Контрольный осмотр бмп 2: Объем и последовательность работ при проведении КО перед выходом из парка, перед боем, на привалах при совершении марша.

Содержание

Объем и последовательность работ при проведении КО перед выходом из парка, перед боем, на привалах при совершении марша.

Контрольный осмотр проводится перед выходом ма­шины из парка (перед боем) и на привалах при совершении марша. Цель контрольного осмотра — проверить готовность машины к выходу (к бою) или к продолжению движения, если он прово­дится на привале во время марша.

Продолжительность проведения контрольного осмотра перед выходом 15—20 мин, на привалах—10—15 мин.

Объем и последовательность работ при проведении КО перед выходом БМП из парка.

Командир отделения:

— проверяет работу радиостанции, внутренней связи, приборов наблюдения и руководит членами экипажа.

Механик-водитель и один из членов отделения:

— проверяет действия штурвала, педалей рычагов управления;

— проверяет исправность наружного освещения, габаритных фонарей, стоп сигналов и звукового сигнала;

— проверяет наличие зарядного тока путем запуска двигателя;

— проверяет работу контрольных приборов;

— проверяет работу прибора ТВНО-2;

— проверяет открытие заслонов эжектора.

Наводчик-оператор:

— проверяет работу, крепление приборов наблюдения, готовность пулемета и орудия их исправность, работу механизмов привода по горизонтали и вертикали.

Пулеметчик и один из автоматчиков:

— проверяет работоспособность гнезд крепления АК, ПК в десантном отделении, освещение, крепление сидений, крепление ЗИПов находящихся в боевом отделении.

Гранатометчик:

— проверяет наличие и крепление крышек и пробок в днище БМП, систему смазки, охлаждения и при необходимости до заправить, а также проверить отсутствие течи в системах.

Объем и последовательность выполнения работ при ежедневном техническом обслуживании БМП членами экипажа

Ежедневное техническое обслуживание (ЕТО) проводится после каждого выхода машины в эксплуатацию, неза­висимо от пробега, но не реже чем через 200—250 км.

Цель ежедневного технического обслуживания — проверить и подготовить машину к дальнейшей эксплуатации, выполнив работы, предусмотренные объемом обслуживания.

Продолжительность ежедневного технического обслуживания БМП—2,5—3,0 ч.

двигателя.

Цель, периодичность и время на проведение ЕТО

Цель ЕТОсостоит в проверке технического состояния машины и подготовке ее к дальнейшей эксплуатации.

Продолжительность ЕТО на БМП 2,5-3,0 часа.

ЕТО проводится после каждого выхода машины в эксплуатацию, независимо от пробега, но не реже им через 200-250 км.

Занятие № 1.Цель контрольного осмотра(КО), периодичность и отводимое на него время. Объем и распределение работ между членами экипажа.

Особенности организации и методики проведения занятия

1. При проведении контрольного осмотра каждый член экипажа выполняет свои обязанности изложенные в соответствующих заданиях. Контроль, за ходом выполнения заданий контрольного осмотра БМП по времени осуществляется руководителем занятия. При этом контрольный осмотр отрабатывается перед выходом БМП из парка и на привалах раздельно.

2. Промывка фильтров, установка и снятие АКБ проводиться по парно.

3. Перед началом занятия л/с должен быть предупрежден, о том, что запускать двигатель только по команде командира.

4. Занятие рекомендуется проводить при выходе на полевые занятия.

 

 

Правильное и своевременное техническое обслуживание машины обеспечивает безотказное действие всех ее сборочных единиц. Высокое качество и быстрота проведения технического обслуживания машины значительно зависят от правильной организации выполнения всех работ, установленных для каждого вида технического обслуживания.

Контрольный осмотр машины перед выходом проводится перед каждым выходом из парка или перед боем для проверки исправности машины и дозаправки ее при необходимости эксплуатационными материалами. Продолжительность осмотра 15-20 минут.

Контрольный осмотр машины на привалах проводится через 2-3 часа движения на марше в целях проверки исправности и готовности машины к дальнейшему движению. Продолжительность осмотра 10-12 минут.

Для машины предусмотрены следующие виды технического обслуживания:

1. Контрольный осмотр (КО) — перед каждым выходом из парка или перед боем (на привалах), продолжительностью 15-20 минут.

2. Ежедневное техническое обслуживание (ЕТО) — после возвращения машины из эксплуатации независимо от пройденного километража и количества отработанных двигателем часов. Продолжительность 2-3 часа.

3. Техническое обслуживание №1 — через 2500-2600 км пробега. Продолжительность 5-6 часов.

4. Техническое обслуживание №2 — через 4800-5000 км пробега. Продолжительность 8-10 часов.

При использовании машины в условиях, требующих специальной подготовки и дополнительных работ, проводятся:

— подготовка машины к стрельбе;

— обслуживание машины после стрельбы;

— подготовка машины к преодолению водных преград и обслуживание после их преодоления;

— подготовка машины к летней или зимней эксплуатации;

— подготовка машины к хранению;

Начальник военной кафедры

При ЕНУ им. Л.Н. Гумилева

Генерал-майор У. Еламанов

«___» ______________ 201___ г.

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА

по ТЕХНИЧЕСКОЙ ПОДГОТОВКЕ для студентов, обучающихся по

специальности «Организация воспитательной и социально-правовой работы в мотострелковых подразделениях» (ВУС-800100) Программа 2011 г.


Тема №5.Контрольный осмотр БМП.

Занятие № 1.Цель контрольного осмотра(КО), периодичность и отводимое на него время. Объем и распределение работ между членами экипажа.

Изучение материала темы должно воспитывать у студентов:

1. Чувство необходимости постоянного контроля за техническим состоянием БТВ и Т, бережного отношения к ней, необходимости строгого соблюдения требований и условий по организации и техническому обслуживанию броневого корпуса и башни БМП.

2. Чувство понимания зависимости боевой готовности подразделений и частей от технического состояние вооружения и техники, ответственности командиров подразделений за поддержание техники в исправном состоянии.

Время: 80 минут

Метод: групповое занятие

Место: учебный класс по технической подготовке

Литература:

1.«Наставление по танко-техническому обеспечению (соединение, часть, подразделение)»;

2. Методическое пособие по технической подготовке. Воениздат.

3. «Боевые машины мотострелковых подразделений», Воениздат.

4. «Боевая машина пехоты БМП-2» Техническое описание и инструкция по эксплуатации, часть 1, Воениздат.

Материальное обеспечение:

1. Боевая машина БМП-2-1 ед. класс тех.подготовки

2. Боевая машина БМП-1-2 ед. класс тех.подготовки

 

 

Учебные вопросы и распределение времени:

№ п/п Составные части занятия Время
(мин)
1.
 
2.
3.
Вводная часть
Организация занятия
Осно Основная часть
Учебные вопросы:
1. Цель контрольного осмотра(КО), периодичность и отводимое на него время.
2. Объем и распределение работ между членами экипажа.
Заключительная часть
Разбор занятия, подведение итогов.

 

 

 

 
 

 
 

Организационно-методические указания к теме:

Согласно «Программе подготовки офицеров запаса из числа студентов ВУЗов (ВУС-800100)» и «Тематическому плану по технической подготовке» для студентов, обучающихся по специальности ВУС-800100 для изучения темы № 5 по технической подготовке «Контрольный осмотр БМП» отводится 2 часа (80 минут) учебного времени. Занятие проводится в специализированном классе методом группового занятия.

Постоянная исправность и готовность машины к использованию обеспечивается планово-предупредительной системой технического обслуживания, предусматривающей обязательное проведение определенного вида работ по техническому обслуживанию после установленного этапа использования.

ТО заключается в чистке, мойке машины, дозаправке или подтягивании креплений узлов, агрегатов и соединений трубопроводов, регулировке механизмов и систем, выявления и устранения неисправностей узлов и агрегатов, проверке работоспособности механизмов и оборудования.

Контрольный осмотр производится членами экипажа перед выходом машины из парка, перед боем, на малых привалах, перед преодолением и после преодоления водных преград, с целью проверки исправности машины и готовности ее к дальнейшему использованию.

 

Серия плакатов «Техническое обслуживание БМП-1 и БМП-2»

Предлагаем вашему вниманию серию из 14 плакатов (на 48 листах) по устройству и техническому обслуживанию боевых машин пехоты БМП-1 и БМП-2.

К сожалению ограниченный ресурс времени не позволяет сразу выложить всю серию (она еще в работе), но по мере окончания работ мы будем прикреплять к этому сообщению новые ссылки.

Итак, вам предлагается файлы в формате corelDRAW-X4, изготовленных из оригинальных «бумажных» плакатов путем сканирования и последующей обработки изображений. Обращаем Ваше внимание, что в этих файлах весь текст перенабран заново в «векторе» а картинки вставлены отдельными растровыми изображениями, это позволяет свободно менять фон плакатов, редактировать текст, переставлять изображения, либо использовать их отдельно для создания презентаций или раздаточного материала.

Итак пожалуйста:

кол-во листов Название плаката
Плакат 1 4 Контрольный осмотр БМП-1
Плакат 2 4 Контрольный осмотр вооружения БМП-2
Плакат 3 4 Ежедневное техническое обслуживание БМП-1 (часть 1)
Плакат 4 4 Ежедневное техническое обслуживание БМП-1 (часть 2)
Плакат 5 4 Техническое обслуживание БМП-1 (часть 1)
Плакат 6 4 Техническое обслуживание БМП-2 (часть 2)
Плакат 7 4 Техническое обслуживание БМП-1
Плакат 8 4 Карта смазки БМП-2
Плакат 9 4  ОТСУТСТВУЕТ В КОЛЛЕКЦИИ
Плакат 10 2 Подготовка БМП-2 к эксплуатации в зимних условиях.
Плакат 11 2 Подготовка БМП-1 к эксплуатации в зимних условиях.
Плакат 12 2 Подготовка БМП-2 к эксплуатации в летних условиях
Плакат 13 2 Подготовка БМП-1 к эксплуатации в летних условиях
Плакат 14 4 ЗИП боевой машины пехоты БМП-1

БМП-1 Ежедневное техническое обслуживание плакат первый

БМП-1 Ежедневное техническое обслуживание плакат второй

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Как мы говорили выше, со временем страница наполнится новыми плакатами по теме

Полный список литературы изданной ГАБТУ

Вернуться в раздел БМП-2

В Помощь Молодому Офицеру — Технологич_карта_БМП_1_д2

Номер и содержание операции Количество человек Время на выполнение операций, мин Примечание
2. 1 Проверить отсутствие течи ГСМ и охлаждающей жидкости из двигателя, систем силовой установки, агрегатов трансмиссии и узлов ходовой части (выполняются в районе сосредоточения сразу после остановки машины) 3 15 Проверять в объеме контрольного осмотра машин на привале
2.2 Дозаправить машину топливом, при необходимости, — охлаждающей жидкостью и маслом 3 10 Марка дизельного топлива должна соответствовать ГОСТ и температуре окружающего воздуха
2.3 Расконсервировать орудие (пушку) и пулеметы. Проверить их техническое состояние 3 120 При обнаружении следов коррозии или неисправности произвести чистку и устранить неисправность
2.5 Проверить количество жидкости в гидрооткатнике, при необходимости дозаправить 2 10 Заливать жидкость из масленки до вытекания
Требуется 1300-1340 куб см.
2.6 Произвести выверку прицельных приспособлений 3 30 Выверку производить, согласно Инструкции по эксплуатации данной системы
2.7 Проверить работоспособность приводов наведения 2 20 Проверять плавностью изменения скорости наведения орудия: поворотом башни в обе стороны, подъемом и опусканием орудия со скоростью от минимальной до максимальной. При этом не должно быть рывков и задержек
2.9 Проверить работоспособность противотанкового комплекса 2 20 Проверять, согласно Инструкции по эксплуатации машины
2.10 Проверить работоспособность приборов наблюдения и прицеливания в ночном режиме 3 40 Проверять, согласно Инструкции по эксплуатации данной марки прибора
2. 11 Проверить работоспособность системы коллективной защиты (ПАЗ и ППО) 4 40 Проверять, согласно Инструкции по эксплуатации машины
2.12 Заправить водой бачки системы воздушно-жидкостной очистки прибора 1 10 Заправлять водой только в летнее время
2.13 Проверить надежность крепления оборудования и ЗИП снаружи и внутри машины 3 5 Проверять внешним осмотром, при необходимости закрепить
2.14 Проверить надежность крепления крышек люков и пробок на корпусе машины 3 10 Проверять внешним осмотром, при необходимости закрепить 2.15 Провести техническое обслуживание ходовой части (в случае выхода в район сосредоточения) 3 10 Проводить техническое обслуживание в объёме ЕТО 2. 16 Смазать подшипник выключения главного фрикциона 1 5 Количество заправляемой смазки (60г) контролировать по делениям на стержне шприц-пресса
2.17 Снарядить патронами ленты пушки и пулемета. Подготовить боекомплект к загрузке в машину 3 150 Предварительно ленты и боеприпасы очистить от консервационной смазки
2.18 Загрузить боекомплект в машину 3 50 Надежно закрепить боекомплект на штатных местах
2.19 Проверить работоспособность радиостанции и ТПУ 4 30 Проверять согласно Инструкции по эксплуатации радиостанции, с соблюдением режима работы
2.20 Закрепить на штатных местах в машине табельное имущество 3 15

20.

Виды, цель и периодичность техническое обслуживание машины

Постоянная
исправность и готовность машины к
использованию обеспечивается
планово-предупредительной системой
технического обслуживания, предусматривающей
обязательное проведение определенного
вида обслуживания в полном объеме после
установленной наработки, календарного
времени или этапа эксплуатации.
Техническое обслуживание, своевременно
и правильно выполненное, обеспечивает
постоянную готовность машины, надежную
работу и длительный срок ее службы.
Техническое обслуживание заключается
в чистке и мойке машины, дозаправке или
смене ГСМ, охлаждающей и рабочей
жидкостей, смазке агрегатов, подтягивании
креплений узлов, агрегатов и соединений
трубопроводов, регулировке механизмов
и систем, выявлении и устранении
неисправностей узлов и агрегатов,
проверке работоспособности механизмов
и оборудования. Для поддержания машины
в технически исправном и готовом
состоянии предусмотрены следующие виды
технического обслуживания: контрольный
осмотр машины перед выходом проводится
перед каждым выходом из парка или перед
выполнением задания для проверки
исправности машины и дозаправки ее при
необходимости эксплуатационными
материалами, продолжительность осмотра
15—20 мин; контрольный осмотр машины на
привалах проводится через 2—3 ч движения
на марше с целью проверки исправности
и готовности машины к дальнейшему
движению, продолжительность осмотра
10—12 мин; ежедневное техническое
обслуживание (ЕТО) проводится после
возвращения машины в парк или после
выполнения задания независимо от
пройденного километража, продолжительность
обслуживания 2,5—3,0 ч; техническое
обслуживание вооружения после стрельбы
(занятий, учений). При ежесуточном расходе
патронов более 500 шт. техническое
обслуживание пушки после стрельбы
проводить через 500 выстрелов; на корпусах
ведущих колес и кронштейнах поддерживающих
катков допускаются намины от касания
вершинами гребней траков; установку
стяжных хомутиков на соединительные
шланги трубопроводов выполнять согласно
рис. 180, при этом расстояние между
хомутиком и торцом шланга, должно быть
не менее 3 мм. При установке двух хомутиков
на одну сторону шланга рамка 3 одного
хомутика не должна ложиться на ленту 2
другого, при этом расстояние между
рамками по окружности должно быть не
менее 15 мм.

Устройство бронетанкового вооружения » MIRLIB.RU

Название: Устройство бронетанкового вооружения
Автор: Янковский И.Н. и др.
Издательство: Минск: Белорусский национальный технический университет
Год: 2019
Формат: pdf
Страниц: 500
Для сайта: mirlib.ru
Размер: 21 mb
Язык: Русский

Настоящее учебное пособие предназначено для изучения курсантами кафедры «Бронетанковое вооружение и техника» БНТУ устройства танка Т-72Б и боевой машины пехоты БМП-2. Может быть использовано при подготовке младших командиров и офицеров запаса.
Оглавление
Общее устройство танка Т-72Б
Введение
Вводная лекция
Общее устройство танка Т-72Б
Общее устройство танка Т-72Б
Корпус и башня
Cиловая установка танка Т-72Б
Двигатель танка Т-72Б
Двигатель танка Т-72Б
«Общее устройство системы питания двигателя топливом»
«Топливный насос высокого давления НК-12М и его привод»
Общее устройство системы питания двигателя воздухом
Воздушная система
Система охлаждения и подогрева двигателя
Общее устройство системы смазки двигателя
Трансмиссия и ходовая часть танка Т-72Б
Трансмиссия танка
Общие сведения о силовой передаче (трансмиссии)
Кинематическая схема БКП
Механические приводы управления трансмиссией
Назначение и устройство механизмов распределения
Общее устройство и принцип работы системы гидроуправления и смазки трансмиссии
Ходовая часть и оборудование для подводного вождения танка
Устройство и работа ходовой части танка
Оборудование для самоокапывания и подводного вождения танка
Специальное оборудование и электрооборудование боевых машин. система защиты. противопожарное оборудование. средства маскировки
Общее устройство системы электрооборудования, источники электрической энергии
Общее устройство системы электрооборудования, источники электрической энергии
Общее устройство системы электрооборудования, источники электрической энергии
Обслуживание и характерные неисправности АКБ
Стартер-генератор СГ-10-1 и его привод
Стартер-генератор СГ-10-1. Стартерный режим. Генераторный режим
Потребители электрической энергии
Потребители электрической энергии
Устройство защиты агрегатов и дорожная сигнализация
Потребители электрической энергии
Контрольно-измерительные приборы (КИП). Уход за потребителями электрической энергии, вспомогательным электрооборудованием и КИП
Системы защиты экипажа и оборудования
Система защиты экипажа от оружия массового поражения
Противопожарное оборудование. Средства маскировки
Средства пожаротушения и маскировки
Особенности устройства других марок боевых машин. Современные направления в развитии бронетанкового вооружения и техники
Общее устройство боевой машины пехоты БМП-2. Силовая установка БМП-2
Общее устройство, боевая и техническая характеристика боевой машины пехоты БМП-2
Двигатель БМП-2. Устройство и работа системы питания двигателя топливом
Система питания двигателя воздухом БМП-2
Система смазки двигателя БМП-2
Система охлаждения и подогрева БМП-2
Пневмооборудование БМП-2 и система запуска двигателя воздухом
Трансмиссия БМП-2
Трансмиссия БМП-2
вный фрикцион и коробка передач БМП-2
Планетарные механизмы поворота и остановочные тормоза БМП-2
Ходовая часть БМП-2
Особенности устройства боевой машины пехоты БМП-2
Особенности устройства электроспецоборудования БМП-2
Классификация и сравнительная характеристика образцов БТВ. Направления в развитии бронетанкового вооружения и техники
Сравнительная характеристика силовых установок БТВ
Силовая установка перспективного танка Т-14 «Армата»
Сравнительная характеристика силовых установок БТВ
Защищенность БТВ
Особенности устройства БТР-80
Особенности устройства БТР-80
Силовая установка БТР-80
Трансмиссия БТР-80
Ходовая часть БТР-80
Перечень работ контрольного осмотра Т-72Б
Перечень работ контрольного осмотра БМП-2
Ежедневное техническое обслуживание
Работы выполняемые при техническом облуживании №1 и №2 танка Т-72Б

Нашел ошибку? Есть жалоба? Жми!
Пожаловаться администрации

Информация

Посетители, находящиеся в группе Гости, не могут оставлять комментарии к данной публикации.

КОМПЛЕКСНЫЙ ТРЕНАЖЕР ЭКИПАЖА БОЕВОЙ МАШИНЫ ПЕХОТЫ БМП-3Ф

Комплексный тренажер экипажа танка Т-55М

Комплексный тренажер экипажа танка Т-55М Основные характеристики Конструктивная адекватность отделения управления и боевого отделения Функциональная адекватность Высокое качество визуализации Трехмерные

Подробнее

Комплексный тренажер экипажа танка Т-72М1

Комплексный тренажер экипажа танка Т-72М1 Основные характеристики Конструктивная адекватность отделения управления и боевого отделения Функциональная адекватность Высокое качество визуализации Трехмерные

Подробнее

Предназначение тренажера

1 Предназначение тренажера Комплексный тренажер экипажа БТР-80 предназначен для решения задач программы боевой подготовки подразделений, вооруженных бронетранспортерами БТР-80 и обеспечивает: а)одиночную

Подробнее

Комплексный тренажер экипажа танка Т-64БВ

Комплексный тренажер экипажа танка Т-64БВ Основные характеристики Конструктивная адекватность отделения управления и боевого отделения Функциональная адекватность Высокое качество визуализации Трехмерные

Подробнее

Репозиторий БНТУ. Оглавление

370 Оглавление ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ…3 1. ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ УСТРОЙСТВА ТАНКА…5 2. БОЕВАЯ И ТЕХНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА… 11 3. КОРПУС И БАШНЯ… 29 3.1. Корпус… 29 3.2. Бортовые щитки… 32 3.3. Башня…

Подробнее

Тренажер тактической подготовки

Тренажер тактической подготовки ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ Формирование, закрепление и совершенствование практических навыков командиров мотострелковых и танковых взводов и рот по организации боя, управлению подразделениями

Подробнее

6. Типы помех — тепловые,, дымовые,, аэрозольные,, Солнце,, облака,, оптико-электронные;

ПЗРК типа «Игла» Тренажер предназначен для повышения эффективности разведывательной, технической и специальной подготовки личного состава подразделений, вооруженных ПЗРК типа «Игла» Игла». Применение оригинальных

Подробнее

изделие «ТРИАДА» ААВФ

изделие «ТРИАДА» ААВФ.201219.007 1 Назначение и технические характеристики 1.1.1 Изделие «Триада», является универсальным комплексом управления огнем (ОЭС) для легкобронированной техники, предназначено

Подробнее

FORWARD c 3 мониторами

Универсальный тренажер легкового автомобиля FORWARD c 3 мониторами Автотренажер представляет собой современный аппаратно-программный комплекс, предназначенный для первоначального обучения водителей, а

Подробнее

Бронетранспортер БТР-82А

Бронетранспортер БТР-82А Бронетранспортер БТР-82А является модернизацией бронетранспортера БТР-80А. Предназначен для использования в мотострелковых подразделениях сухопутных войск против однотипных изделий,

Подробнее

ПАНЕЛЬ УПРАВЛЕНИЯ НАВОДЧИКА

ПАНЕЛЬ УПРАВЛЕНИЯ НАВОДЧИКА Панель управления наводчика выполнена на основе монохромной газоразрядной индикаторной панели белого цвета свечения с информационной емкостью 1280х1024 элементов отображения

Подробнее

RU (11) (51) МПК G09B 9/00 ( )

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) RU (11) (1) МПК G09B 9/00 (06.01) 167 371 (13) U1 ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ (21)(22) Заявка: 161784, 26.0.16

Подробнее

Молодежный научно-технический вестник ФС

УДК 623.418.2 МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ РАЗРАБОТКИ ИМИТАТОРА-ТРЕНАЖЕРА РАБОЧИХ МЕСТ ЗРК ДД-СД ДЛЯ ПОДГОТОВКИ СПЕЦИАЛИСТОВ ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ РАДИОТЕХНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НАВЕДЕНИЯ ЗРК ПВО ВВС Тимофеев Г.Г., студент

Подробнее

Предназначение системы ТОС-1А

Предназначение системы ТОС-1А Система ТОС-1А предназначена для непосредственной поддержки в различных видах наступательного и оборонительного боя мотопехоты и танков, передвигаясь в порядках поддерживаемых

Подробнее

Погрузчик-зернометатель скребковый

Погрузчик-зернометатель скребковый ПЗС 60 «Муравей» Высокая маневренность Большой выбор модификаций Простота в обслуживании Загрузка складов с высотой складирования зернового материала до 6 м. дальностью

Подробнее

Разработка и создание «Стенда АФУ»

Разработка и создание «Стенда АФУ» При проектировании самолета антенны бортового радиоэлектронного оборудования должны быть размещены из условий получения необходимых диаграмм направленности для каждого

Подробнее

Шкафы автоматизации и телеметрии SINETIC

Общие сведения. Сфера применения Панель серии SP63 выполнена на базе современного частотно-регулируемого преобразователя переменного тока с микропроцессорным управлением. Панель предназначена для управления

Подробнее

ТРЕНАЖЕРЫ АВИАЦИОННЫЕ

н ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР ТРЕНАЖЕРЫ АВИАЦИОННЫЕ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОСТ 21659 76 Издание официальное ГО СУД АРСТВЕН Н Ы Й КОМ ИТЕТ СТАНДАРТО В СО ВЕТА МИНИСТРОВ СС СР ультразвуковая диагностика

Подробнее

ИНТЕРАКТИВНЫЕ КОМПЬЮТЕРНЫЕ СИСТЕМЫ

ИНТЕРАКТИВНЫЕ КОМПЬЮТЕРНЫЕ СИСТЕМЫ О компании Основана в 2004 году Производитель интерактивных стрелковых тренажеров и интегратор интерактивных решений Высокое качество поставляемой продукции и предлагаемого

Подробнее

Ограничения по применению РЛПК Су-27

Ограничения по применению РЛПК Су-27 РЛПК автоматически осуществляет захват цели. При достижении дальности до цели при атаке в ППС менее 40 км, а в ЗПС менее 15 км. Дальность действия РЛПК в свободном

Подробнее

изделие «ТРЕК-М» ААВФ

изделие «ТРЕК-М» ААВФ.201219.004-01 1. Изделие «Трек-М» представляет собой оптико-электронную систему управления огнем (ОЭС), предназначенную для наблюдения и обнаружения наземных целей (бронетехника,

Подробнее

2 Технические характеристики

АИП ЭМФ предназначен для удаления окислов железа из турбинного конденсата на атомных и тепловых электростанциях. АИП ЭМФ содержит источник питания постоянного тока для фильтра магнитной очистки, аппаратные

Подробнее

178 11,8 9,3 5,5 6,9 5МТ 3,9

LADA VESTA 1497 технические характеристики 860 2635 915 4410 1510 1510 2039 1764 Кузов Колесная формула / ведущие колеса Расположение двигателя Тип кузова / количество дверей Длина / ширина / высота, мм

Подробнее

ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ ОБЪЕКТЕ

Приложение ТЕХНИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ на разработку беспилотного летательного аппарата с видеокамерой Разработал Фомин А.А. 01.11.2015 ВВЕДЕНИЕ Настоящее техническое задание (ТЗ) является документом, в соответствии

Подробнее

Ультразвуковой генератор «УЗГ-100»

ОКП 34 1500 Ультразвуковой генератор «УЗГ-100» РМПА 11.00.000.01 ПС 2016 г. 2 УЗГ-100 Настоящее руководство по эксплуатации содержит сведения о конструкции, принципе действия, технических характеристиках

Подробнее

АГРЕГАТЫ НАСОСНЫЕ АНД ТУ У ПРИМЕНЕНИЕ

АГРЕГАТЫ НАСОСНЫЕ АНД ТУ У 00110792.020-95 1.ПРИМЕНЕНИЕ Агрегаты насосные модельного ряда АНД предназначены для перекачивания воды при оросительных, строительно-монтажных, осушительных и других работах

Подробнее

1

Методика определения потребной мощности приводов перспективного испытательно-измерительного тренажерного стенда для освоения и оценки работоспособности специального оборудования быстроходных машин # 10,

Подробнее

Видеосмотровое устройство 1ВУ2С (ВАФЯ ТУ)

Видеосмотровое устройство 1ВУ2С (ВАФЯ.467844.026ТУ) Видеосмотровое устройство (далее ВСУ) на основе монохромной плазменной панели информационной емкостью 768х576 элементов отображения. ВСУ выполнен в общеклиматическом

Подробнее

Наличие учебного оборудования

Наличие учебного оборудования Оборудование учебного кабинета 42 по адресу осуществления образовательной деятельности: 414057, г. Астрахань, ул. Н. Островского 127 / Джона Рида 18 Перечень учебного оборудования,

Подробнее

АГРЕГАТЫ СВАРОЧНЫЕ АДД ТУ У ПРИМЕНЕНИЕ

1.ПРИМЕНЕНИЕ Сварочные агрегаты модельного ряда АДД с приводом от дизельных двигателей предназначены для питания одного или двух постов при ручной дуговой сварке, резке и плавке металлов постоянным током,

Подробнее

Запчасти для автокранов

Запчасти для автокранов Каталоги запчастей автокранов Привод насоса Установка опоры поворотной Лебедка грузовая Обойма крюковая Механизм поворота Электрооборудование Гидрооборудование Приборы безопасности

Подробнее

ОГЛАВЛЕНИЕ

http://library.bntu.by/brel-m-p-bronetankovoe-vooruzhenie-elektrooborudovanie-i-specialnye-sistemy-tanka-t-72b ОГЛАВЛЕНИЕ ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ… 3 ПРЕДИСЛОВИЕ… 5 1. СОСТАВ И РАЗМЕЩЕНИЕ ЭЛЕКТРООБОРУДОВАНИЯ

Подробнее

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Цель курса обучение безопасному вождению транспортных средств, применение полученных знаний на практике. ТРЕБОВАНИЯ К УРОВНЮ ОСВОЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ В результате изучения курса

Подробнее

Руководство по эксплуатации

31.10.10.300 Код продукции ПРИВОД ЭЛЕКТРИЧЕСКИЙ ВЕНТИЛЬНЫЙ РМ 108 250M Руководство по эксплуатации ООО Электротехника Новые Технологии 1. Основные технические данные 1.1 Привод электрический вентильный

Подробнее

ЭЛЕКТРОДВИГАТЕЛИ НИЗКОВОЛЬТНЫЕ ВАО7А(М)

ЭЛЕКТРОДВИГАТЕЛИ НИЗКОВОЛЬТНЫЕ ВАО7А(М)-250-355 Электродвигатели асинхронные трехфазные с короткозамкнутым ротором обдуваемые взрывозащищенные ВА07 предназначены для работы в шахтах, опасных по газу и

Подробнее

Кодекс ливневых вод

— SDCI | seattle.gov

См. Также: Код аттестации, Разрешение на аттестацию, Кодекс для боковой канализации, Разрешение на установку боковой канализации

Что это такое?

Кодекс и руководство по ливневым водам находятся в процессе обновления и вступят в силу в июле 2021 года. Дополнительную информацию см. На нашей странице «Обновление правил по ливневым водам».

Кодекс и руководство по ливневым водам 2016 года вступили в силу 1 января 2016 года.

Наши правила в отношении ливневых вод защищают людей, имущество и окружающую среду от ущерба, причиненного ливневым стоком.Наши нормы по ливневым сточным водам также удовлетворяют обязательство города по соблюдению нашего Разрешения на выбросы муниципальных ливневых вод в рамках Национальной системы ликвидации выбросов загрязняющих веществ (NPDES), выданного Департаментом экологии штата Вашингтон.

Наш кодовый адрес для ливневых вод:

  • Подача и рассмотрение требований по контролю дренажа
  • Куда должна уйти ливневая вода с вашего участка
  • Управление ливневыми водами на месте (ранее называлось «Инфраструктура зеленых ливневых вод») и почему это важно
  • Требования к контролю над эрозией для вашего проекта во время строительных и планировочных работ
  • Требования к регулированию потока и очистке ливневых вод
  • Как мы обеспечиваем соблюдение Кодекса о ливневых водах

Нужна ли проверка дренажа?

Вам необходимо получить разрешение на дренаж для получения разрешения на строительство или профилирование, если:

  • Вы нарушаете более 750 квадратных футов земли
  • Вы добавляете или заменяете более 750 квадратных футов твердого покрытия, например тротуара
  • Вы добавляете или заменяете более 750 квадратных футов здания (если измерять по контуру крыши)
  • Для вашего проекта требуется разрешение на аттестацию
  • Ваш проект находится в зоне, подверженной оседанию торфа категории I согласно SMC 25.09.020

Прочитать код

Кодекс ливневой воды 2016 года — это Раздел 22, подзаголовок VIII Муниципального кодекса Сиэтла (SMC). Вы можете найти код ливневой канализации на веб-сайте муниципального кодекса Сиэтла.

Прочитать руководство

Руководство города Сиэтл по ливневым водам состоит из пяти томов и набора приложений.

Ниже находится Руководство по ливневым водам, разбитое на разделы.

Формы и документы

Необходимые документы

Проекты с нарушением земель площадью более 750 квадратных футов должны предоставить следующие документы.

Примечание. Если в вашем проекте 5 000 квадратных футов или больше новой плюс замененной твердой поверхности, ваше приложение должно быть подготовлено профессиональным инженером. См. Раздел «Для профессиональных инженеров» далее на этой веб-странице.

Документация по управлению ливневыми водами на месте

В Кодексе и руководстве по ливневым водам 2016 года требования «Управление ливневыми водами на месте» (OSM) заменяют предыдущие требования к экологической инфраструктуре ливневых вод (GSI). Осуществимость управления ливневыми водами на месте, выбор наилучшей практики управления и определение размеров наилучшей практики управления должны быть задокументированы в Калькуляторе метода управления ливневыми водами на месте — составить список.

Требования к расследованию проникновения

Если ваш проект требует управления ливневыми водами на месте или должен соответствовать стандартам контроля потока или качества воды, вы должны сначала изучить возможность использования инфильтрационных сооружений (таких как сухой колодец) для соответствия этим стандартам. Исключение составляют случаи, когда ваш проект расположен в области, обозначенной как «Расследование проникновения не требуется». Карта «Расследование проникновения не требуется» доступна вам в качестве базового слоя карты на нашем веб-сайте ГИС.Если вам необходимо провести тестирование на проникновение, вы должны отправить контрольные списки на предмет заражения вместе со своими планами. Если проникновение не требуется, вы должны указать причину в сводке по контролю за местом и дренажем.

Питательные вещества, важные для получения воды

На момент разработки настоящего Руководства не существовало критических для питательных веществ участков водоприемника, которые были бы повреждены из-за фосфора, внесенного ливневыми водами. В будущем городские власти могут определить водный объект как водоприемник с критически важными питательными веществами, как это определено в Разделе 22 SMC.801.150.

Стандартные образцы

Вот список документов, которые помогут вам понять наш код для ливневой канализации:

Для профессиональных инженеров

Для более крупных проектов может потребоваться подача дополнительных документов.

  • В проектах площадью менее 10 000 квадратных футов новой и замененной твердой поверхности с требованиями к управлению потоком можно использовать калькулятор предварительного размера для управления потоком
  • В проектах площадью более 10 000 квадратных футов новой и замененной непроницаемой поверхности, требующей контроля потока, необходимо использовать серию «Сиэтл» 158-летней выдержки / испарения

Примечание: Серия осадков / испарений за 158 лет Сиэтла включена в качестве опции в модель гидрологии Западного Вашингтона 2012 года (WWHM 2012) и модели непрерывного стока затопления MGS.

  • WWHM 2012 Инструкции по выбору временных рядов
    • На «Экране картографической информации» выберите карту «Сиэтл».
    • Затем выберите параметр временного ряда «SPU 158 Year 5min»
    • В раскрывающемся меню «Просмотр» на панели задач выберите «Параметры» и перейдите на вкладку «Временной шаг».
    • Затем выберите соответствующий временной шаг для типа проектируемого объекта (см. Таблицу F.12, Приложение F, раздел F-4 Руководства по ливневым водам Сиэтла 2016 г.).
  • Инструкции по выбору временного ряда

  • MGS Flood
    • На экране «Информация о проекте» в раскрывающемся списке «Выбрать климатический регион» выберите «32.Сиэтл 38 КАРТА »
    • Затем перейдите к экрану «Моделирование».
    • В раскрывающейся строке «Расчетный временной шаг» выберите соответствующий временной шаг для типа проектируемого объекта (см. Таблицу F.12, Приложение F, раздел F-4 Руководства по ливневым водам Сиэтла, 2016 г.).

Примечание: Мы не предоставляем техническую поддержку для утвержденных гидрологических моделей непрерывных осадков или в применении модели для конкретных проектов.Консультанты, желающие обучиться использованию утвержденных моделей, могут связаться напрямую с этими компаниями:

Вам нужно общее разрешение на строительство или промышленные ливневые воды?

Общее разрешение Департамента экологии на строительство для ливневых вод требуется для проектов, нарушающих один или несколько акров земли, или для проекта любого размера, который потенциально может быть значительным источником загрязняющих веществ (например, загрязненные участки).

См. Веб-страницу общего разрешения на промышленные ливневые воды Департамента экологии, чтобы определить, требуется ли Генеральное разрешение на промышленные ливневые воды для вашего участка.

Инспекция передовых методов управления ливневыми водами (BMP)

Правильно построенные и обслуживаемые BMP имеют решающее значение для достижения более высокого качества воды для нашего сообщества в целом.

Управление ливневыми водами после строительства обычно осуществляется с помощью передовых методов управления ливневыми стоками (BMP). Эти BMP включают в себя построенные системы инфильтрации ливневых вод, системы биологического удержания, центры задержания ливневых вод или различные промышленные системы.Более распространенные названия — дождевые сады, биологическое удерживание, песчаные фильтры, резервуары для задержания и системы инфильтрации.

Системы биозадержания используют растительность, такую ​​как деревья, кустарники и травы, для удаления загрязняющих веществ из ливневых стоков. Источники стока отводятся в системы биологического удержания непосредственно через систему ливневой канализации.

Дождевой сад — это впадина, которая собирает ливневые стоки с крыши, подъездной дорожки или двора и позволяет им проникать в землю.Дождевые сады обычно засажены кустарниками и многолетниками (местными растениями).

Все типы BMP предназначены для смягчения последствий застройки за счет уменьшения объема и скорости стока ливневых вод при одновременном удалении загрязняющих веществ и улучшении качества стока.

Ниже приведены ссылки на формы проверки, постановления и правила, а также примеры BMP. В соответствии с постановлением города владельцы БМП должны предоставлять отчеты о проверках и техническом обслуживании сотрудникам муниципального предприятия Ливневой системы города Колумбия до 15 ноября каждого года.

Требования этого постановления о BMP являются обязательными в соответствии с нашим разрешением MS4 (Муниципальная отдельная ливневая канализация) от EPA. * Национальная система устранения выбросов загрязняющих веществ (NPDES) — Контроль после строительства. Агентство по охране окружающей среды США, Вашингтон, округ Колумбия.

Согласно правилу фазы II ливневой канализации, владельцы и операторы небольших муниципальных объектов отдельной ливневой канализационной системы (MS4) несут ответственность за реализацию программ инспекции и технического обслуживания BMP и наличие штрафных санкций для предотвращения нарушений.Все БМУ для ливневых вод должны регулярно проверяться на постоянную эффективность и структурную целостность.

Требования владельцев БМП в соответствии с Распоряжением 12A-95

  • Согласно Постановлению города 12A-95 « Техническое обслуживание и ремонт ливневых сооружений » требуется ежегодная проверка БМП.
  • Согласно постановлению города владелец БМП должен ежегодно до 15 ноября предоставлять городу формы проверки и журнал технического обслуживания.
  • Меры контроля ливневых вод или BMP должны надлежащим образом и регулярно обслуживаться для правильного функционирования. Владелец (и) несет ответственность за поддержание BMP в хорошем рабочем состоянии.
  • Во время каждой проверки инспектор должен задокументировать, правильно ли работает БМП , если БМП была повреждена с момента последней проверки, и, если да, указать , что будет сделано для ее ремонта .
  • В случае вегетативных или других инфильтрационных BMP, проверка методов управления ливневыми водами после штормового события должна проводиться после ожидаемого периода просадки для данной BMP.Это позволяет инспектору видеть, правильно ли опорожняются устройства задержания и проникновения.
  • Формы проверки были разработаны для использования инспекторами BMP ( см. Формы ниже ). Предоставленные формы помогут инспектору определить потребности в ремонте или ремонте.
  • Хорошо осведомленное и квалифицированное лицо или компания может выполнять техническое обслуживание и инспекцию объектов BMP. Рекомендуется, чтобы осмотр проводил зарегистрированный инженер-строитель или ландшафтный архитектор.
  • Компания по ландшафтному дизайну или обслуживанию собственности, имеющая опыт работы с BMP, может иметь опыт проведения инспекции и / или технического обслуживания.
  • Важно, чтобы текущее обслуживание и внеплановый ремонт ливневых БМУ выполнялись согласно графику или сразу после обнаружения проблемы. Поскольку многие BMP становятся неэффективными для контроля стока, если они не установлены и не обслуживаются должным образом, очень важно, чтобы графики технического обслуживания и ремонт производились своевременно.
  • Пожалуйста, приложите изображение (-а) BMP вместе с формой проверки и записями о техническом обслуживании и отправьте их по электронной или обычной почте (см. Электронную почту и почтовый адрес ниже) .

Шаг 1: Загрузите формы проверки BMP

Шаг 2: Загрузите журнал обслуживания

Шаг 3: Сделайте текущее изображение BMP

Шаг 4: Отправьте формы проверки BMP, журнал технического обслуживания и фотографии на:

Предпочтительный способ по электронной почте:

Snail Mail: Stormwater Utility — W.W.T.P

Город Колумбия, штат Миссури,
P.O. Box 6015
Columbia, MO 65205-6015

Внимание:

_______

Форма (формы) для проверки и контрольного списка по типу BMP:

  • 4
  • 08

    ШАГ 1:

    9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015

    (все типы валков)

    9015 50

    (зерно / маслоотделитель)

    * Пожалуйста, прочтите специальные инструкции, предоставленные по этой ссылке.

    ШАГ 2:

    ШАГ 3:

    Сделайте текущее изображение (я) BMP

    9014 Отправить форму (s) , Журнал технического обслуживания и фотографии на:

    Если у вас есть вопросы или вам нужна помощь, свяжитесь с нами:

    Stormwater Utility — W.W.T.P
    Город Колумбия, штат Миссури,
    P.O. Box 6015
    Columbia, MO 65205-6015

    Главный офис очистных сооружений: 573.445.9427

    Обратитесь в службу Stormwater Engineering:

    Прямой телефон:

  • 7 573.874.8

    Электронная почта:

  • Если вы проектируете / строите новую БМП для ливневых вод, по этой ссылке можно найти шаблон Соглашения об управлении ливневыми водами / сооружения БМП, график проверок владельца БМП и график технического обслуживания владельца БМП.

    _______

    _______

    Назад на главную страницу Stormwater Engineering

    Ген костного морфогенетического белка-2 контролирует развитие корня зуба в координации с формированием пародонта

    Реферат

    Формирование пародонта начинается после начала формирования корня зуба скоординированно после рождения. Предполагается, что клетки-предшественники зубных фолликулов образуют цемент, альвеолярную кость и волокна Шарпея пародонтальной связки (PDL).Однако мало что известно о регуляторных морфогенах, которые контролируют дифференцировку и функцию этих клеток-предшественников, а также о клетках-предшественниках, участвующих в формировании кроны и корня. Мы исследовали роль костного морфогенетического белка-2 (Bmp2) в этих процессах путем условного удаления гена Bmp2 на мышиной модели Sp7-Cre-EGFP. Sp7-Cre-EGFP сначала становится активным на E18 в первом моляре, с устойчивой активностью Cre на постнатальный день 0 (P0), затем следует активность Cre во втором моляре, которая возникает после P0.К 2-недельному возрасту в пародонте и третьих молярах наблюдается высокая активность Cre. Когда ген Bmp2 удаляется из клеток Sp7 + (Osterix + ), в корне, клеточном цементе и формировании пародонта отмечаются серьезные дефекты. Во-первых, существуют основные автономные клеточные дефекты в терминальной дифференцировке корня и одонтобластов. Во-вторых, наблюдаются серьезные изменения в формировании PDL и клеточного цемента, коррелирующие со снижением ядерного фактора IC (Nfic), периостина и клеток α-SMA + .В-третьих, неспособность продуцировать фактор роста эндотелия сосудов А (VEGF-A) в периодонте и пульпе приводит к снижению образования микрососудистых и связанных стволовых клеток-кандидатов в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . В-четвертых, функция амелобластов и образование эмали косвенно изменяются в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . Эти данные демонстрируют, что ген Bmp2 играет комплексную роль в постнатальном развитии зубов и формировании пародонта.

    Ключевые слова: Ген Bmp2 , цемент, дентиногенез, развитие пародонта, формирование корня

    Введение

    Чтобы регенерировать зуб и его поддерживающие структуры, необходимо иметь глубокие знания о критических событиях, которые регулируют нормальное развитие зубов и пародонта.Процесс цементогенеза зависит от образования корня зуба. Когда начинается формирование корня зуба, внутренний и внешний эпителий эмали разрастаются и образуют двухслойную эпителиальную оболочку корня Хертвига. 1,2 После образования корневого дентина эпителиальная оболочка корня Гертвига перфорируется, и вновь образованный корневой дентин входит в контакт с клетками зубного фолликула. 3 Предполагается, что эпителиальные сигналы от эпителиальной оболочки корня Хертвига ответственны за дифференцировку клеток-предшественников зубных фолликулов в цементобласты 4 с образованием цемента.Более того, было показано, что костный морфогенетический белок-2 (Bmp2) способствует дифференцировке иммортализованных клеток зубных фолликулов в направлении фенотипа остеобластов / цементобластов. 5 Однако роль Bmp2 в проявлении его эффектов на развитие корня зуба и его поддерживающих тканей, таких как периодонтальная связка (PDL) и цемент, а также на васкулогенез пульпы in vivo не исследовалась.

    Ранее мы показали, что Bmp2 играет критическую роль в постнатальном развитии зубов и цитодифференцировке при делеции в зрелых одонтобластах. 6 Мы также представили модель, в которой терминальная дифференцировка одонтобластов требовалась для создания петли обратной связи для контроля васкуляризации и стволовых клеток-кандидатов для одонтобластов. Чтобы протестировать компоненты этой модели, мы удалили ген Bmp2 (Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP ) с помощью мышиной модели Sp7-Cre-EGFP, которая экспрессирует Cre в подмножестве клеток пульпы зуба, очень ранних остеобластах. , преодонтобласты и в подмножестве клеток зубных фолликулов. Теперь мы сообщаем о связи между геном Bmp2 в клетках Sp7 + с критическими ролями в цементогенезе, а также с формированием и организацией периодонтальных связок и координацией с формированием корня зуба.Наши результаты должны предоставить фундаментальные знания для понимания факторов и клеток, регулирующих формирование корня зуба и пародонта. Это также заложит прочную основу для разработки новых и эффективных терапевтических подходов к восстановлению и регенерации корня зуба и пародонта.

    Материалы и методы

    Мыши

    Все исследования на мышах проводились в соответствии с надлежащими инструкциями по использованию экспериментальных животных, как определено в наших протоколах и политике IACUC-UTHSCSA по использованию экспериментальных животных.Флоксированные мыши Bmp2 описаны в Yang et al. 7 Мыши Sp7-Cre-EGFP были получены от Энди МакМахона из Гарвардского университета. 8 Bmp2 fx / fx мышей скрещивали с Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / + для получения гетерозигот дикого типа (WT) (Het, Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / +) и Bmp2-cKO Sp7 Cre-EGFP (Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / Bmp2fx). Мыши Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-LSL-tdTomato) были получены от Jackson Laboratories (Мэн).

    Картирование клеток Sp7-Cre-EGFP

    + и событий Cre с репортером Rosa-LSL-tdTomato

    мышей Sp7-Cre-EGFP скрещивали с репортерными мышами Rosa-LSL-tdTomato, затем срезы криостата на ленточной системе визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. 7 Зеленая ядерная флуоресценция отмечает клетки, которые экспрессируют Cre, а красный цвет цитоплазмы отмечает событие Cre и потомство клеток Sp7-Cre-EGFP + у мышей. Первые, вторые и третьи моляры были картированы в постнатальный день 0 (P0) и в возрасте 2 недель.

    Гистология, гистоморфометрическая оценка и кислотное травление пластиковых залитых нижних челюстей

    Ткани нижних челюстей были собраны из Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP и их контрольных однопометников на нескольких постнатальных стадиях.Нижние челюсти с левой стороны были подготовлены для рентгенологического исследования, а правые нижние челюсти были подготовлены для гистологического исследования костей и зубов. Образцы нижней челюсти фиксировали в 4% формальдегиде, не содержащем РНКазы, деминерализовали в 15% этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА), не содержащей РНКаз, в течение 6 недель (меняли один раз в неделю) и заливали парафином. 6 Затем были приготовлены восьмимикронные срезы для толуидинового синего, 9 гематоксилина и эозина с оранжевым G, пикросириуса ed 10 и красителя Ван Гизона 11 для коллагеновых пучков.Чтобы оценить степень созревания кальцификации и минерализации, образцы нижней челюсти фиксировали в 70% этаноле в течение 3 дней с последующей заливкой пластиковой смолой без деминерализации и разрезали на срезы 8 мкм. В некоторых экспериментах поверхность полировалась и шлифовки готовились для кислотного травления и оценки с помощью сканирующей электронной микроскопии. 9

    Рентгенография

    Использовали самцов мышей в возрасте 2 недель, 1 месяца и 3 месяцев, а образцы нижней челюсти обрабатывали и хранили в 70% этаноле для получения рентгеновских лучей с высоким разрешением.Цифровые рентгеновские изображения получали с использованием радиографической инспекционной установки Faxitron (модель MX-2 Faxitron; Field Emission Corporation, Inc., Тусон, Аризона, США).

    Микрокомпьютерный томографический анализ

    Количественный микрокомпьютерный томографический анализ нижней челюсти проводился на животных в возрасте 1, 2 и 3 месяцев. Общий объем дентина, корешкового (корневого) дентина, эмали и общий объем пульпы, а также объем пародонта определяли количественно в первом и втором молярах в возрасте 1, 2 и 3 месяцев, по одной мыши каждого генотипа в возрасте 1 месяца. каждого возраста.Всего 12 моляров были оценены по указанным параметрам, объединив данные трех возрастов для статистической оценки, и как подробно описано в Yang et al. 6

    Гибридизация in situ

    Ткани для гибридизации in situ обрабатывали без РНКаз с помощью диэтилпирокарбонатной (DEPC) воды во всех реагентах. Ткани фиксировали в 4% формальдегиде в течение ночи, декальцинировали в забуференном 15% EDTA при 4 ° C в течение 4-6 недель, заливали парафином, помещали на предметные стекла ProbeON Plus (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США) и держали при 4 ° C. С.Все РНК-зонды для in situ гибридизации транскрибировали in vitro в присутствии дигоксигенина для получения антисмысловых и смысловых зондов с полимеразами Т3, Т7 или SP6, где это необходимо. Срезы сначала депарафинизировали и обрабатывали протеиназой К. Гибридизацию проводили при 58 ° C в течение ночи с концентрацией зонда 1 мкг · мл -1 . После гибридизации в течение ночи срезы обрабатывали РНКазой, промывали 5XSSC и 50% формамидом в 2XSSC.Обнаружение сигнала гибридизации осуществляли путем добавления субстрата щелочной фосфатазы (NTB / BCIP; Roche Diagnostic Corp., Даллас, Техас, США) в буфере для обнаружения (10% поливиниловый спирт 70–100 кДа, 100 ммоль⋅л -1 Tris, pH 9, 100 ммоль⋅л -1 NaCl, 2 ммоль⋅л -1 левамизол; Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, Миссури, США). Продолжительность развития сигнала гибридизации составляла от 1 часа до ночи при 30 ° C, в зависимости от зонда и количества транскрипта в ткани. Затем срезы слегка окрашивали метиловым зеленым.Процедуры гибридизации in situ и численной оценки экспрессии мРНК выполняли, как описано ранее. 6,11

    Иммуногистохимия

    Иммуногистохимия выполнялась, как описано ранее. 6,11 Первичные антитела включали поликлональные кроличьи антимышиные антимышиные эндотелиальные факторы роста А (VEGF-A), Ab9571 (1–200), кроличьи антимышиные CD146, Ab75769 (1–200) и кроличьи антимышиные α- SMA, Ab5694 (1–200), были получены от Abcam Limited (Бостон, Массачусетс, США).Поликлональный кроличий антимышиный ядерный фактор IC (Nfic), LS-B4029 (1-200) был получен от LifeSpan BioSciences, Inc. (Сиэтл, Вашингтон, США), кроличий антимышиный Smad1 / 5/8 (1-200) был получен от Cell Signaling Technology, Inc. (Бостон, Массачусетс, США), а кроличий антимышиный периостин (1-100) был получен от Innovative Research (Нови, Мичиган, США).

    Иммунофлуоресценция

    Нижние челюсти мышей из контроля (WT и Het) и Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP фиксировали в 4% формальдегиде без РНКазы, деминерализовали в 15% EDTA без РНКазы в течение 1 недели (меняли каждый день). дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) в течение 30 мин и помещали в 30% сахарозу на ночь при 4 ° C.Нижние челюсти были серийно разрезаны в продольной плоскости 8 мкм с помощью криостата. Срезы тканей помещали на предметные стекла Superfrost (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США). Затем образцы инкубировали в блокирующем растворе, состоящем из 4% нормальной козьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 2% бычьего гамма-глобулина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 0,3% Triton X -100 (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США) в PBS в течение 60 мин перед инкубацией в течение 16 ч в первичных антителах кроличьи антимышиные Ki67, Ab15580 (1-50), кроличьи антимышиные α-SMA, Ab5694 (1∶ 50) и крысиные антитела против CD31 мыши, Ab7388 (1-50).Эти антитела были получены от Abcam Limited. Кроличья антимышиная расщепленная каспаза 3 (1-50) была получена от Cell Signaling Technology. Срезы промывали в PBS, а затем инкубировали в козьих антикроличьих антителах Alexa Fluor 568 и вторичных козьих антителах против крыс Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США) в разведении 1 × 100. Первичные и вторичные антитела разводили в блокирующем растворе. Предметные стекла промывали в PBS, воде, сушили на воздухе и покрывали флуоресцентным покрытием с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), и иммунореактивность визуализировали с помощью конфокального микроскопа в нашем Core Optical. Оборудование для визуализации (Olympus FV-1000 с четырьмя лазерами и ДИК; Olympus, Center Valley, PA, USA).Контрольные препараты состояли из соседних срезов, окрашенных точно так же, как экспериментальные срезы, за исключением того, что в них отсутствовали первичные антитела, а на некоторых предметных стеклах отсутствовали первичные и вторичные антитела.

    Анализ мечения ник-концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP

    Использовали набор для определения гибели клеток in situ , TMR красный (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США). Восьмимикронные залитые в парафин срезы контроля и Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP депарафинизировали в ксилоле и этаноле (абсолютные, 95%, 90%, 80% и 70%, разведенные в бидистиллированной воде), промывали в PBS. , обработанный протеиназой К, не содержащий нуклеаз (20 мкг · мл -1 в 10 ммоль · л -1 Трис-HCl, pH 7.5) в течение 30 мин и промыть PBS. Затем срезы инкубировали в реакционной смеси для мечения ник-концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL) (смесь раствора метки и раствора фермента) в течение 60 мин при 37 ° C во влажной атмосфере в темноте. Затем предметные стекла промывали в PBS (трижды по 5 минут каждое), покрывали флуоресцентным экраном с DAPI и оценивали под конфокальным микроскопом. В случае отрицательного контроля срезы обрабатывали раствором метки вместо реакционной смеси TUNEL.Для положительного контроля срезы обрабатывали ДНКазой 1, степени 1 (3000 U⋅mL -1 в 50 ммоль⋅L -1 Tris-HCl, pH 7,5, 1 мг⋅ мл -1 бычий сывороточный альбумин ) за 10 мин до обработки реакционной смесью TUNEL. Реакцию TUNEL визуализировали с помощью конфокального микроскопа.

    Статистический анализ

    Тест Стьюдента t и дисперсионный анализ были выполнены для сравнения данных между Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP и контрольными мышами их однопометников (WT и Het) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism и Microsoft Excel. P <0,05 считали статистически значимым. Для иммуноцитохимии оценивали по крайней мере два независимых помета для каждого антитела с двумя-тремя срезами на нижнюю челюсть от данного животного.

    Результаты

    Характеристика модели Sp7-Cre-EGFP и экспрессии в нижней челюсти

    Используя модель мыши Sp7-Cre-EGFP и репортер Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato, мы картировали клетки внутри и вокруг структуры зубов, которые подверглись Cre-рекомбинации и развились в новые линии (отмечены выражением Red tdTomato).Следовательно, мы можем проследить за их потенциальным развитием в родословной. В наших первоначальных экспериментах мы использовали модель мыши Sp7-Cre-EGFP и репортер Rosa26-LSL-tdTomato, чтобы продемонстрировать наличие большого количества клеток Sp7 + (зеленые) в пульпе, одонтобластах и ​​остеобластах альвеолярных костей. постнатальный день 0 (P0), с большим количеством событий Cre (красный) в пульпе и в одонтобластном слое первого моляра. В точке P0 наблюдается небольшое количество клеток Sp7 + (события Cre) во втором моляре (дополнительные рисунки S1d и S1h).Дополнительный рисунок S1h также не показывает активности третьего моляра. В возрасте 2 недель наблюдается большое количество клеток Sp7 + в пульпе, пародонте и области апикального сосочка (зеленый). Многие из потомков (красный цвет), скорее всего, станут корневыми одонтобластами, цементобластами, остеобластами альвеолярной кости и / или фибробластами PDL (). На дополнительном рисунке S2 показана аналогичная картина в области коронки второго моляра в этом 2-недельном возрасте. Дополнительная фигура 3 показывает клетки Sp7 + и их потомство (красный цвет) в третьем моляре в возрасте 2 недель.Следует отметить, что не было клеток Sp7 + или событий Cre ни в одном из эпителиальных компонентов, включая все стадии амелогенеза либо в возрасте P0, либо в возрасте 2 недель на первом, втором или третьем молярах. Когда мы скрестили эту модель Sp7-Cre-EGFP с моделью Bmp2-floxed, мы обнаружили сложный фенотип, который включает нарушение формирования корня зуба и связанного с ним пародонта, а также амелогенез. 12

    Исследования клонов путем картирования активности Cre в первом моляре постнатальных мышей нулевого дня с помощью конфокальной микроскопии с использованием Olympus FV 1000.Показаны комбинированных ядер, окрашенных DAPI (синий), клеток Sp7-Cre-EGFP + (зеленый) и tdTomato + (красный) (событие Cre). ( a ) Низкое увеличение первого и второго моляров с высокой активностью Cre в альвеолярной кости и первом моляре, но не обнаруживаемой активности Cre во втором моляре. ( b ) Sp7 + зеленый сигнал от EGFP. ( c ) Сигнал tdTomato, представляющий события Cre и ячейки, полученные из событий Cre (красный прямоугольник). ( d ) Показано при большом увеличении (× 400) области коронки первого моляра.Am, амелобласты; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; ДП, зубно-пульповая камера; Od, одонтобласты.

    Исследования клонов путем картирования активности Cre в области корня второго моляра у двухнедельной мыши с помощью конфокальной микроскопии с использованием Olympus FV 1000. Комбинированные ядра, окрашенные DAPI (синие), Sp7-Cre-EGFP Показаны ячейки + (зеленый) и tdTomato + (красный). ( a ) Изображение DIC. ( b ) Sp7 + Сигнал EGFP. ( c ) Сигнал tdTomato, представляющий событие Cre и ячейки, полученные из событий Cre.AP — апикальный сосочек; БВ — кровеносный сосуд; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; Dp, зубно-пульповая камера; Od, одонтобласты; PDL, область периодонтальной связки.

    Фенотип мышей Bmp2-cKO

    Sp7-Cre-EGFP в зубе и поддерживающих структурах

    In, экспрессия экзона 3 Bmp2 снижена более чем на 85% в одонтобластах и ​​в субпопуляции клеток пульпы в молярах. Стрелки указывают на синий сигнал гибридизации. Зеленый цвет — это контрастное пятно метиленового зеленого.Обратите внимание на уменьшенное количество клеток пульпы зуба, гибридизующихся с зондом Bmp2 Exon 3, что указывает на делецию Bmp2 в подмножестве клеток Sp7 + в пульпе. Модель Sp7-Cre-EGFP эффективна при удалении экспрессии экзона 3 Bmp2, как показано и численно оценено. 6 Bmp2 Экзон 3 также удален в подмножестве клеток пародонта (). Экспрессия очень высока в ранних одонтобластах у контрольных мышей и снижается по мере завершения дентиногенеза к 1 месяцу (). В то время как экспрессия Bmp2 снижается через 4 дня и 2 недели по сравнению с контролем, экспрессия Bmp2 снижается через 1 месяц ( n = 2).Уровни фосфо-Smad1 / 5/8, считывание передачи сигналов Bmp, снижаются уже на E18 как в амелобластах, так и в одонтобластах первого моляра (). Это указывает на активность Cre уже на E18, и что Bmp2 в развивающихся одонтобластах косвенно влияет на передачу сигналов Bmp в эпителиальном амелобласте. 12 Окрашенные гематоксилином и эозином срезы моляров мыши показывают сильный фенотип зубов уже через 4 дня на первом моляре (и). И одонтобласты, и амелобласты дисморфны и не могут дифференцироваться в сильно поляризованные структуры.

    Ген Bmp2 удален как в одонтобласте, так и в области периодонтальной связки, а передача сигналов Bmp2 снижена как в одонтобластах, так и в амелобластах. ( a d ) Bmp2 Exon 3 in situ гибридизация через 2 недели в пульпе зуба, одонтобласте и PDL. ( e , f ) Числовая оценка 6 через 4 дня, 2 недели и 1 месяц первых моляров нижней челюсти ( a f ). Bmp2 Exon 3 уменьшается через 4 дня и 2 недели по сравнению с контролем (> 90%).Экспрессия Bmp2 обычно снижается по мере завершения терминальной дифференцировки и отмечается с небольшим изменением экспрессии экзона 3 Bmp2 через 1 месяц в первых молярах нижней челюсти. ( г , ч ) Иммуногистохимия Phospho-Smad1 / 5/8 в контроле и Bmp2-cKO Sp7Cre-EGFP первых моляров нижней челюсти у эмбрионов E18. ( i , j ) Окрашивание H&E первых моляров нижней челюсти у 4-дневных контрольных мышей и мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . Обратите внимание на начало тяжелого фенотипа зубов как в амелобластах, так и в одонтобластах.Am, амелобласты; Bmp2, костный морфогенетический белок-2; Dp, зубно-пульповая камера; H&E, гематоксилин и эозин; Od, одонтобласты; PDL, пародонтальная связка.

    показывает анализ μCT контрольных мышей Het Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / + (4A) и Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP (). Мы количественно определили общий объем дентина (), объем корневого дентина (), объем корневой пульпы (), объем эмали () и объем пародонта () в первом и втором молярах контрольных мышей и мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . в возрасте 1, 2 и 3 месяцев, объединение данных для всех трех возрастов для статистической оценки. Общий объем дентина уменьшился на 30-40% как на первом, так и на втором моляре (), а корневой дентин уменьшился на 50%. –80% ().Соответствующий объем корневой пульпы увеличивается примерно в три раза (). Как отмечено в, объем эмали уменьшается на 25% в первом моляре с аналогичной тенденцией во втором моляре. Объем пародонта значительно увеличивается до 30% на вторых молярах, с аналогичной тенденцией на первых молярах (). Дополнительный рисунок. S4 показывает аналогичные результаты в возрасте 6 недель как на первых, так и на вторых молярах. На рисунке рентгеновский анализ демонстрирует увеличенную камеру пульпы (синяя стрелка внутри) с неспособностью сформировать правильные корни () и более тонкий корневой дентин у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP в возрасте 1 () и 3 месяцев. () по сравнению с контрольными животными.Мы также заметили эктопические минерализованные области в пульпе возле апикальной области корня у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP , что было подтверждено гистологическим исследованием (синяя стрелка) в нижней челюсти 1,5-месячных мышей. . Материал выглядит как аномальный дентин с клетками внутри, похожими на кость, или остеодентин (OtD). Кроме того, у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre EGFP клеточный внутренний волокнистый цемент (CIFC) значительно снижен, как показано (синяя стрелка), по сравнению с мышами.Однако никаких явных изменений в бесклеточном внешнем волокнистом цементе не наблюдалось (зеленая стрелка). Используя 3-месячные залитые пластиком нижние челюсти мыши в сочетании с кислотным травлением и сканирующей электронной микроскопией, мы отметили, что корни не были хорошо развиты, а CIFC был значительно снижен, как показано на (красная стрелка). Мы также подтвердили присутствие остеоденина (розовая стрелка внутри и обозначена как OtD). Кроме того, высота альвеолярной кости была уменьшена (красная полоса внутри), а дентинные канальцы были дефектными в отсутствие гена Bmp2 (синяя стрелка внутри).

    μCT анализ нижней челюсти у контрольных мышей Het и Bmp2-cKO Sp7CreEGFP в возрасте 1 месяц, 2 месяца и 3 месяца. ( a , b ) Изображения всей нижней челюсти и образцы срезов до середины, показывающие примеры с этими 3-месячными данными различных компонентов, которые были количественно определены для всех возрастов как на первых, так и на вторых молярах. Первый коренной зуб, эмаль, розовая; корончатый дентин, желтый; коронная мякоть, зеленая; корневой дентин, пурпурный; корневая пульпа, ржавчина; пародонтальный объем, синий.Второй моляр, эмаль, голубой; корончатый дентин, желтый; корончатая мякоть, пурпурная; корневой дентин, светло-зеленый; корневая мякоть, красная; пародонт объемный, темно-синий. ( c , d ) Количественное определение общего объема дентина и объема корневого дентина в первом и втором молярах. ( e ) Количественное определение объема корневой пульпы (неминерализованной) в первом и втором молярах. ( f ) Количественное определение объема эмали первого и второго моляров. ( г ) Количественное определение объема пародонта на первом и втором молярах.** P <0,01, * P <0,05. Всего были определены 12 моляров, шесть контрольных моляров и шесть моляров Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP, первый и второй. Bmp2, костный морфогенетический белок-2.

    Делеция гена Bmp2 в клетках Sp7 + (Osterix + ) приводит к потере корнеобразования, дисморфической дифференцировке одонтобластов и неспособности образовывать клеточный цемент. ( a d ) Цифровые рентгеновские снимки контрольных и Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP нижней челюсти мыши через 1 месяц ( a и b ) и 3 месяца ( c и d ) с использованием рентгеновского излучения высокого разрешения Faxitron.Рентгеновский анализ демонстрирует увеличенную камеру пульпы (синие стрелки) с неспособностью сформировать правильные корни с более тонким корневым дентином (красные стрелки) в возрасте 1 и 3 месяцев Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP по сравнению с контрольными гетерозиготными животными . ( e j ) Гистология 1,5-месячных контрольных мышей Het и Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . В e и h зеленые стрелки указывают на AEFC. g и j показывают CIFC, синяя стрелка и желтая стрелка указывают на аномальную минерализацию или OtD в камере пульпы корня, j l показывают аномальное развитие корня зуба и образование цемента, что выявлено кислотным травлением пластмассы встроенные и СЭМ 3-месячных третьих моляров нижней челюсти от мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP по сравнению с контрольным WT.Красные полоски обозначают уровень образования альвеолярной кости между зубами и ширину пародонта. Низкое увеличение, красная стрелка и метка указывают на хорошо сформированный клеточный цемент в контрольной WT ( k ), но мало организованный клеточный цемент виден в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP (-1 ). Обратите внимание на OtD в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP (розовая стрелка в l ) у основания корней. ( m , n ) Большое увеличение области корня, показывающее нормальные дентинные канальцы в WT ( m ) и сильно дисморфные дентинные канальцы в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP ( n ).Зеленая рамка, область показана в e и h при большом увеличении. Синяя рамка, площадь показана в г и х при большом увеличении. Синяя рамка, область показана в м и n при большом увеличении. AEFC, бесклеточный цемент из внешних волокон; Bmp2, костный морфогенетический белок-2; CIFC, клеточный цемент с собственными волокнами; ОТД, остеодентин; СЭМ, растровый электронный микроскоп.

    Sp7 является ключевым фактором транскрипции для образования CIFC 9 и образования корней и непосредственно регулирует коллаген, тип 1 и альфа 1 (Col1a1) в усилителе остеобластов и, возможно, напрямую регулирует дентин, сиалофосфопротеин и белок 1 матрикса дентина.Sp7 также напрямую регулирует VEGF через проксимальную область промотора. 13 Как показано на фиг.1, экспрессия мРНК протеина 1 матрикса дентина (), сиалофосфопротеина дентина (), Col1a1 () и Sp7 () значительно снижена на 80–95%, по данным численной оценки в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP животных (дополнительный рисунок S6). 6 Имеются наводящие на мысль данные, что Sp7 на самом деле может быть частью набора факторов транскрипции, который регулирует ядерный фактор IC (Nfic) и частью сети генов транскрипции с прямой связью.Поскольку Nfic является ключевым фактором транскрипции для формирования корня зуба и формирования пародонта, 14,15,16,17,18 мы провели гибридизацию in situ для экспрессии Nfic и экспрессии белка Nfic с помощью иммуноцитохимии (). Как показано на рисунке, мРНК Nfic снижается на 85% (дополнительный рисунок S6) в корневых одонтобластах этих первых моляров в возрасте 2 недель.

    In situ гибридизации. ( a , b ) Dmp1; ( c , d ) Dspp; ( e , f ) Col1a1; ( г , ч ) Sp7; ( i , j ) Nfic в контроле и мыши Bmp2-cKO Sp7Cre-EGFP первых моляров нижней челюсти в возрасте 2 недель.Пруток = 20 мкм. Численная оценка изменений уровней этих ключевых факторов транскрипции, участвующих в формировании корня, и ключевых маркеров терминальной дифференцировки одонтобластов представлена ​​на дополнительном рисунке S6. Col1a1, коллаген, тип 1, альфа 1; Dmp1, белок 1 матрикса дентина; Dspp, сиалофосфопротеин дентина; Nfic, ядерный фактор IC; Od, одонтобласты.

    Делеция гена Bmp2 в клетках Sp7 + (Osterix + ) приводит к дезорганизации пародонтальных связок, снижению экспрессии периостина и Nfic и снижению экспрессии VegfA в области пародонта и корневых одонтобластов. ( a , b ) краситель Ван Гизона для коллагеновых пучков и волокон контроля и Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP области пародонта, соответственно, при × 400. Желтая линия обозначает ширину пародонта. Черные стрелки — пучки волокон пародонтальной связки, богатых коллагеном типа 1 в пародонте, с дезорганизованными волокнами Шарпея у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . ( c , d ) Окрашивание коллагена пикросириусом красным показывает сильно дезорганизованные волокна Шарпея (белые стрелки) у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre EGFP ( d ) по сравнению с контролем (). c ) при × 200.( e , f ) In situ гибридизация периостина при × 200. ( г , ч ) Иммуногистохимия периостина в контроле и Bmp2-cKO Sp7Cre-EGFP PDL при × 100. a h получены от мышей в возрасте 1,5 месяца. ( i , j ) Иммуногистохимия Nfic в контроле и Bmp2-cKO Sp7Cre-EGFP вторых моляров при × 200. ( k , l ) Иммуногистохимия VEGF-A в контроле и Bmp2-cKO Sp7Cre-EGFP вторых моляров при × 200. i l от месячных мышей, вторые моляры. Синяя стрелка указывает на пародонт, а фиолетовая стрелка указывает на корневые одонтобласты. Bmp2, костный морфогенетический белок-2; Nfic, ядерный фактор IC; VEGF, фактор роста эндотелия сосудов A.

    Анализы пролиферации клеток и апоптоза в модели Bmp2-cKO

    Sp7-Cre-EGFP

    Используя 2-недельные нижние челюсти в иммунофлуоресцентном анализе Ki67, мы не отмечаем серьезных изменений в индекс пролиферации между мышами WT и Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP , как показано на дополнительных рисунках S5a и S5b.По-видимому, наблюдается снижение апоптоза по данным анализа с расщепленным антителом к ​​каспазе 3 (дополнительный рисунок S5c и S5d) и анализа TUNEL вдоль участков одонтобласта дентина корня (дополнительный рисунок S5e и S5f) на вторых молярах Bmp2-cKO Sp7-Cre. -EGFP . Мы предполагаем, что это является отражением снижения гибели клеток микрососудистого русла, которое обычно исчезает после одонтогенеза и прекращения образования дентина, или что часть одонтобластов подвергается апоптозу, как и остеобласты, в то время как большинство одонтобластов становятся покоящимися одонтобластами или «одонтоцитами». и выполняет функции в ответах на нагрузку и ремонте.В модели Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP мы имеем недостаточность или снижение терминальной дифференцировки одонтобластов, а также снижение васкуляризации в слое одонтобластов, и то и другое может привести к снижению наблюдаемого апоптоза в отсутствие Bmp2 . ген.

    Кроме того, PDL дисморфны у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . Для дальнейшего изучения и подтверждения этих наблюдений за измененным пародонтом у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP мы выполнили окрашивание по Ван Гизону для пучков коллагеновых волокон.Как показано на примере 1,5-месячных мышей, у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP PDL были сильно дезорганизованы, а периодонтальное пространство увеличивалось (желтая полоса). Между коренными зубами также имеется небольшая альвеолярная кость для прикрепления PDL. Окрашивание пародонта красным пикрозиусом на коллаген в поляризованном свете () показывает сильно дезорганизованные волокна Шарпея у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre EGFP () по сравнению с контролем (). Периостин — это белок внеклеточного матрикса, который высоко экспрессируется в периодонтальной связке.Как показано на фиг.3, наблюдается сниженная экспрессия мРНК периостина () и белка () в PDL у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP .

    Возможный механизм действия Bmp2 на развитие зуба и опорной структуры

    Ранее мы наблюдали, что удаление гена Bmp2 в зрелых одонтобластах привело к снижению васкуляризации пульпы. Это снижение васкуляризации было связано с уменьшением количества стволовых клеток-кандидатов, по крайней мере, одной нишей были капилляры и связанные с ними перициты в пульпе. 6,19 Было показано, что количество фолликулярных стволовых клеток-кандидатов в пародонте уменьшается в модели условного нокаута Sp7. 9 Одним из косвенных механизмов, которые мы предлагаем, является снижение продукции VEGF-A индуцированными Bmp одонтобластами, клетками пульпы и / или другими клетками пародонта, а также предшественниками остеобластов, что приводит к изменениям в популяции стволовых клеток в сосудистых руслах и вокруг них. . 6 Как показано на фиг. И, наблюдается значительное снижение уровней белка VEGF-A в одонтобластах корня (фиолетовая стрелка), а также в периодонте (синяя стрелка) Bmp2-cKO Sp7-Cre- EGFP , а также мышей.

    В костном мозге человека было ясно показано, что клетки CD146 + обладают всеми свойствами мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые могут дифференцироваться в функционирующие остеобласты и другие дифференцированные ткани, такие как хрящи и мышцы. 20,21,22 Большинство этих клеток CD146 + связаны с мелкими кровеносными сосудами и обладают многими свойствами, которые некоторые называют перицитами. 22 Эти ассоциированные с сосудом клетки CD146 + были предложены в качестве стволовых клеток-кандидатов для одонтобластов, а также остеобластов. 23 Предложенная гипотеза заключалась в том, что без образования правильных микрососудистых структур внутри зубов, частично за счет Bmp2-индуцированной продукции VEGF-A, будут снижены уровни этих кандидатов на МСК CD146 + . 6,11 Как показано на фиг.1, CD146 высоко экспрессируется в структурах сосудов и микрососудов в пульпе (пурпурная стрелка) как третьего моляра (), так и резца () этих месячных животных, подвергающихся активному дентиногенезу. Также имеется большое количество микрососудов CD146 + в слое одонтобластов и рядом с ним, как показано на третьих молярах и резцах (соответственно) контрольных мышей.Мы показали значительное снижение CD146 + в микрососудистых структурах в слое одонтобластов (синяя стрелка) и пульпе (фиолетовая стрелка) у однопометных мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP .

    Кандидат в маркер стволовых клеток CD146, связанный с мелкими кровеносными сосудами в слое одонтобластов, снижен в модели Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP , а стволовые клетки αSma + в шейной и апикальной областях пародонта уменьшаются. также значительно уменьшено в модели Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . ( a d ) Маркер стволовых клеток-кандидатов иммуноцитохимии CD146, локализованный в пульпе зуба ( a d , фиолетовые стрелки) и в ассоциации с кровеносными сосудами, прилегающими к слою одонтобластов ( a d , синие стрелки) на капиллярах. Экспрессия белка CD146 значительно снижена в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP у месячных мышей (× 200). a и b от третьих моляров, а c и d от области шейной петли резца.Стволовые клетки-кандидаты, помеченные иммуноцитохимическим методом α-SMA, отмечены все в пародонте первого и второго моляров (данные показаны на дополнительном рисунке S7) и в менее развитых клетках зубных фолликулов третьих моляров ( e и f ). , черная стрелка) и области апикального сосочка ( g и h , черная стрелка). Экспрессия маркера стволовых клеток α-SMA значительно снижена у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP ( ч ) по сравнению с контролем ( г ), например, у второго моляра, возраст 1 месяц, и показано как × 200.Bmp2, костный морфогенетический белок-2.

    Недавно с помощью процедур отслеживания клонов было показано, что клетки α-SMA + являются стволовыми клетками для остеобластов. Клетки 24 Α-SMA + также показали высокую экспрессию как в зубном фолликуле, так и в области апикального сосочка. 25 Наша гипотеза заключалась в том, что клетки α-SMA + в зубном фолликуле и области апикального сосочка могут быть кандидатами стволовых клеток для цемента, периодонтальных связок и остеобластов альвеолярной кости.Чтобы начать исследовать эту идею, мы провели иммуноцитохимию с антителом α-SMA и обнаружили, что клетки α-SMA + значительно уменьшены в зубном фолликуле у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP (черный стрелка) по сравнению с контролем (). Мы также отметили очень высокие уровни клеток α-SMA + в апикальной области сосочка (черная стрелка) по сравнению с Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP (черная стрелка). Считается, что апикальный сосочек содержит стволовые клетки одонтобластов корня и, возможно, стволовые клетки цементобластов, связанные с тканью микрососудов. 26,27 Мы расширили эти результаты с помощью двойных иммунофлуоресцентных анализов с CD31-эндотелием (зеленый) и α-SMA + (красный), как показано на дополнительном рисунке S7. В области пародонта и апикального сосочка в контроле (дополнительный рисунок S7a, S7c и S7e) имеется большое количество красных клеток α-SMA + , локализующихся вокруг иммунного окрашивания CD31, в то время как уровни этих связанных с сосудами α- Клетки SMA + значительно уменьшены у мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP как в области перидонта и апикального сосочка, так и в сосудистых структурах в слое одонтобласта (дополнительные рисунки S7b, S7d и S7f).

    Обсуждение

    Мы обнаружили новые и уникальные роли гена Bmp2 как в развитии пародонта, так и в корне зуба, которые у постнатальных животных кажутся скоординированными. Существуют прямые автономные клеточные эффекты на терминальную дифференцировку одонтобластов, а также дифференцировку клеток-предшественников в компоненты пародонта. Кроме того, дифференцировка эмали и амелобластов была изменена непрямым образом, поскольку не было экспрессии Sp7-Cre-EGFP ни в одной из клонов амелобласт-эпителий, как показывает анализ клонов.Развитие коренных корней было навсегда изменено в Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP . Механизм фенотипа корня зуба и цемента связан с нарушением терминальной дифференцировки, что косвенно приводит к уменьшению количества стволовых клеток-кандидатов, которые представляют собой CD146 + в пульпе зуба, а также уменьшаются в периодонте и области апикального сосочка, которые являются α- SMA + . Считается, что взаимосвязь этих фенотипов связана со снижением васкуляризации в результате снижения Bmp2-зависимой продукции VEGF-A и других факторов, участвующих в васкуляризации и ангиогенезе в пульпе, слое одонтобластов и пародонте. 6 Недавние данные показали с помощью исследований по отслеживанию клонов, что в контексте костного мозга клетки α-SMA + являются предшественниками остеобластов, а клетки α-SMA + в пародонте обладают высокой способностью образовывать минерализующие структуры, похожие на кость и цемент. 24,25

    α-SMA + клетки обнаруживаются не только на многих гладкомышечных клетках более крупных кровеносных сосудов, но также на более мелких микрососудах или стенках капилляров, иногда называемых перицитами.Клетки α-SMA + также разбросаны по всему слою одонтобластов и в области пульпы, не обязательно по микрососудам, и высоко экспрессируются в пародонте. 25 Последние данные с использованием модели резцов и маркера NG2 для перицитов, Feng et al. , 19 показали, что часть этих перицитов может фактически становиться одонтобластами с помощью процедур отслеживания клонов. Кроме того, неперицитная ниша для одонтобластов также была идентифицирована в области петли шейки матки, но все же в области с высокой степенью васкуляризации. 19 Таким образом, кажется, что существует несколько ниш для стволовых клеток даже в области пульпы; Локализация этих ниш МСК не была исследована в контексте развивающихся моляров. Мы предлагаем клетки α-SMA + , по крайней мере, подмножество, являются стволовыми клетками для одонтобластов и для других компонентов поддерживающих структур зубов, таких как цементобласты, фибробласты PDL и остеобласты альвеолярной кости. Наша гипотеза состоит в том, что ген Bmp2 имеет решающее значение для развития зуба и корней зубов в координации с формированием опорных структур зуба.

    Мы также отметили массивный остеодентин в пульпе мышей Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP , что свидетельствует об изменениях и клеточно-автономной дисморфической дифференцировке одонтобластов. Недавние данные показали, что условное удаление индуцированного Bmp2 фактора транскрипции, Sp7, приводит к серьезным дефектам цементогенеза. 9 Фактор транскрипции Sp7 высоко экспрессируется в подмножестве клеток пульпы зуба, одонтобластах, цементобластах и ​​подмножестве клеток зубных фолликулов в пародонте, как продемонстрировано и опубликовано с использованием модели условных KO мышей Sp7. 9 Когда ген Bmp2 удален в этих нескольких типах или состояниях клеток, мы показали серьезные дефекты в формировании корня зуба, а также в цементе, PDL и формировании альвеолярной кости. Основной механизм, по-видимому, частично связан с неспособностью сформировать сосудистую систему в пульпе зуба и в периодонте в отсутствие гена Bmp2 в предшественниках одонтобластов и пародонта. Поскольку в настоящее время существует множество примеров связи васкуляризации и связанных стволовых клеток на стенках сосудов, и что существует сильная корреляция образования кровеносных сосудов и образования остеобластов, мы выдвинули гипотезу, что этот принцип применим ко многим из них. стволовые клетки пульпы зуба и пародонта. 6,7,28,29 Подтверждающие доказательства этой гипотезы представлены уменьшением количества стволовых клеток-кандидатов CD146 + на малых микрососудах в пульпе зуба и снижением продукции VEGF-A, когда ген Bmp2 является снято с Sp7 + ячеек. Было показано, что сверхэкспрессия VEGF-A в костном микроокружении вызывает массивную новую васкуляризацию и образование новой кости. 30

    Другим основным кандидатом в маркеры МСК в периодонте и пульпе зуба является антиген α-SMA.Было показано, что эти α-SMA + клетки обладают свойствами МСК по нескольким критериям. 24,31 Мы показали значительное снижение экспрессии клеток α-SMA + как в области пульпы зуба, так и в периодонте в отсутствие гена Bmp2 .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *