(зерно / маслоотделитель)

* Пожалуйста, прочтите специальные инструкции, предоставленные по этой ссылке.

ШАГ 2:

ШАГ 3:

Сделайте текущее изображение (я) BMP

9014 Отправить форму (s) , Журнал технического обслуживания и фотографии на:

Если вы проектируете / строите новую БМП для ливневых вод, по этой ссылке можно найти шаблон Соглашения об управлении ливневыми водами / сооружения БМП, график проверок владельца БМП и график технического обслуживания владельца БМП.

_______

_______

Назад на главную страницу Stormwater Engineering

Ген костного морфогенетического белка-2 контролирует развитие корня зуба в координации с формированием пародонта

Реферат

Формирование пародонта начинается после начала формирования корня зуба скоординированно после рождения. Предполагается, что клетки-предшественники зубных фолликулов образуют цемент, альвеолярную кость и волокна Шарпея пародонтальной связки (PDL).Однако мало что известно о регуляторных морфогенах, которые контролируют дифференцировку и функцию этих клеток-предшественников, а также о клетках-предшественниках, участвующих в формировании кроны и корня. Мы исследовали роль костного морфогенетического белка-2 (Bmp2) в этих процессах путем условного удаления гена Bmp2 на мышиной модели Sp7-Cre-EGFP. Sp7-Cre-EGFP сначала становится активным на E18 в первом моляре, с устойчивой активностью Cre на постнатальный день 0 (P0), затем следует активность Cre во втором моляре, которая возникает после P0.К 2-недельному возрасту в пародонте и третьих молярах наблюдается высокая активность Cre. Когда ген Bmp2 удаляется из клеток Sp7 ⁺ (Osterix ⁺ ), в корне, клеточном цементе и формировании пародонта отмечаются серьезные дефекты. Во-первых, существуют основные автономные клеточные дефекты в терминальной дифференцировке корня и одонтобластов. Во-вторых, наблюдаются серьезные изменения в формировании PDL и клеточного цемента, коррелирующие со снижением ядерного фактора IC (Nfic), периостина и клеток α-SMA ⁺ .В-третьих, неспособность продуцировать фактор роста эндотелия сосудов А (VEGF-A) в периодонте и пульпе приводит к снижению образования микрососудистых и связанных стволовых клеток-кандидатов в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . В-четвертых, функция амелобластов и образование эмали косвенно изменяются в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . Эти данные демонстрируют, что ген Bmp2 играет комплексную роль в постнатальном развитии зубов и формировании пародонта.

Ключевые слова: Ген Bmp2 , цемент, дентиногенез, развитие пародонта, формирование корня

Введение

Чтобы регенерировать зуб и его поддерживающие структуры, необходимо иметь глубокие знания о критических событиях, которые регулируют нормальное развитие зубов и пародонта.Процесс цементогенеза зависит от образования корня зуба. Когда начинается формирование корня зуба, внутренний и внешний эпителий эмали разрастаются и образуют двухслойную эпителиальную оболочку корня Хертвига. ^1,2 После образования корневого дентина эпителиальная оболочка корня Гертвига перфорируется, и вновь образованный корневой дентин входит в контакт с клетками зубного фолликула. ³ Предполагается, что эпителиальные сигналы от эпителиальной оболочки корня Хертвига ответственны за дифференцировку клеток-предшественников зубных фолликулов в цементобласты ⁴ с образованием цемента.Более того, было показано, что костный морфогенетический белок-2 (Bmp2) способствует дифференцировке иммортализованных клеток зубных фолликулов в направлении фенотипа остеобластов / цементобластов. ⁵ Однако роль Bmp2 в проявлении его эффектов на развитие корня зуба и его поддерживающих тканей, таких как периодонтальная связка (PDL) и цемент, а также на васкулогенез пульпы in vivo не исследовалась.

Ранее мы показали, что Bmp2 играет критическую роль в постнатальном развитии зубов и цитодифференцировке при делеции в зрелых одонтобластах. ⁶ Мы также представили модель, в которой терминальная дифференцировка одонтобластов требовалась для создания петли обратной связи для контроля васкуляризации и стволовых клеток-кандидатов для одонтобластов. Чтобы протестировать компоненты этой модели, мы удалили ген Bmp2 (Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP ) с помощью мышиной модели Sp7-Cre-EGFP, которая экспрессирует Cre в подмножестве клеток пульпы зуба, очень ранних остеобластах. , преодонтобласты и в подмножестве клеток зубных фолликулов. Теперь мы сообщаем о связи между геном Bmp2 в клетках Sp7 ⁺ с критическими ролями в цементогенезе, а также с формированием и организацией периодонтальных связок и координацией с формированием корня зуба.Наши результаты должны предоставить фундаментальные знания для понимания факторов и клеток, регулирующих формирование корня зуба и пародонта. Это также заложит прочную основу для разработки новых и эффективных терапевтических подходов к восстановлению и регенерации корня зуба и пародонта.

Материалы и методы

Мыши

Все исследования на мышах проводились в соответствии с надлежащими инструкциями по использованию экспериментальных животных, как определено в наших протоколах и политике IACUC-UTHSCSA по использованию экспериментальных животных.Флоксированные мыши Bmp2 описаны в Yang et al. ⁷ Мыши Sp7-Cre-EGFP были получены от Энди МакМахона из Гарвардского университета. ⁸ Bmp2 fx / fx мышей скрещивали с Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / + для получения гетерозигот дикого типа (WT) (Het, Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / +) и Bmp2-cKO ^{Sp7 — Cre-EGFP} (Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / Bmp2fx). Мыши Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-LSL-tdTomato) были получены от Jackson Laboratories (Мэн).

Картирование клеток Sp7-Cre-EGFP

⁺ и событий Cre с репортером Rosa-LSL-tdTomato

мышей Sp7-Cre-EGFP скрещивали с репортерными мышами Rosa-LSL-tdTomato, затем срезы криостата на ленточной системе визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. ⁷ Зеленая ядерная флуоресценция отмечает клетки, которые экспрессируют Cre, а красный цвет цитоплазмы отмечает событие Cre и потомство клеток Sp7-Cre-EGFP ⁺ у мышей. Первые, вторые и третьи моляры были картированы в постнатальный день 0 (P0) и в возрасте 2 недель.

Гистология, гистоморфометрическая оценка и кислотное травление пластиковых залитых нижних челюстей

Ткани нижних челюстей были собраны из Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP и их контрольных однопометников на нескольких постнатальных стадиях.Нижние челюсти с левой стороны были подготовлены для рентгенологического исследования, а правые нижние челюсти были подготовлены для гистологического исследования костей и зубов. Образцы нижней челюсти фиксировали в 4% формальдегиде, не содержащем РНКазы, деминерализовали в 15% этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА), не содержащей РНКаз, в течение 6 недель (меняли один раз в неделю) и заливали парафином. ⁶ Затем были приготовлены восьмимикронные срезы для толуидинового синего, ⁹ гематоксилина и эозина с оранжевым G, пикросириуса ed ¹⁰ и красителя Ван Гизона ¹¹ для коллагеновых пучков.Чтобы оценить степень созревания кальцификации и минерализации, образцы нижней челюсти фиксировали в 70% этаноле в течение 3 дней с последующей заливкой пластиковой смолой без деминерализации и разрезали на срезы 8 мкм. В некоторых экспериментах поверхность полировалась и шлифовки готовились для кислотного травления и оценки с помощью сканирующей электронной микроскопии. ⁹

Рентгенография

Использовали самцов мышей в возрасте 2 недель, 1 месяца и 3 месяцев, а образцы нижней челюсти обрабатывали и хранили в 70% этаноле для получения рентгеновских лучей с высоким разрешением.Цифровые рентгеновские изображения получали с использованием радиографической инспекционной установки Faxitron (модель MX-2 Faxitron; Field Emission Corporation, Inc., Тусон, Аризона, США).

Микрокомпьютерный томографический анализ

Количественный микрокомпьютерный томографический анализ нижней челюсти проводился на животных в возрасте 1, 2 и 3 месяцев. Общий объем дентина, корешкового (корневого) дентина, эмали и общий объем пульпы, а также объем пародонта определяли количественно в первом и втором молярах в возрасте 1, 2 и 3 месяцев, по одной мыши каждого генотипа в возрасте 1 месяца. каждого возраста.Всего 12 моляров были оценены по указанным параметрам, объединив данные трех возрастов для статистической оценки, и как подробно описано в Yang et al. ⁶

Гибридизация in situ

Ткани для гибридизации in situ обрабатывали без РНКаз с помощью диэтилпирокарбонатной (DEPC) воды во всех реагентах. Ткани фиксировали в 4% формальдегиде в течение ночи, декальцинировали в забуференном 15% EDTA при 4 ° C в течение 4-6 недель, заливали парафином, помещали на предметные стекла ProbeON Plus (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США) и держали при 4 ° C. С.Все РНК-зонды для in situ гибридизации транскрибировали in vitro в присутствии дигоксигенина для получения антисмысловых и смысловых зондов с полимеразами Т3, Т7 или SP6, где это необходимо. Срезы сначала депарафинизировали и обрабатывали протеиназой К. Гибридизацию проводили при 58 ° C в течение ночи с концентрацией зонда 1 мкг · мл ^-1 . После гибридизации в течение ночи срезы обрабатывали РНКазой, промывали 5XSSC и 50% формамидом в 2XSSC.Обнаружение сигнала гибридизации осуществляли путем добавления субстрата щелочной фосфатазы (NTB / BCIP; Roche Diagnostic Corp., Даллас, Техас, США) в буфере для обнаружения (10% поливиниловый спирт 70–100 кДа, 100 ммоль⋅л ^-1 Tris, pH 9, 100 ммоль⋅л ^-1 NaCl, 2 ммоль⋅л ^-1 левамизол; Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, Миссури, США). Продолжительность развития сигнала гибридизации составляла от 1 часа до ночи при 30 ° C, в зависимости от зонда и количества транскрипта в ткани. Затем срезы слегка окрашивали метиловым зеленым.Процедуры гибридизации in situ и численной оценки экспрессии мРНК выполняли, как описано ранее. ^6,11

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия выполнялась, как описано ранее. ^6,11 Первичные антитела включали поликлональные кроличьи антимышиные антимышиные эндотелиальные факторы роста А (VEGF-A), Ab9571 (1–200), кроличьи антимышиные CD146, Ab75769 (1–200) и кроличьи антимышиные α- SMA, Ab5694 (1–200), были получены от Abcam Limited (Бостон, Массачусетс, США).Поликлональный кроличий антимышиный ядерный фактор IC (Nfic), LS-B4029 (1-200) был получен от LifeSpan BioSciences, Inc. (Сиэтл, Вашингтон, США), кроличий антимышиный Smad1 / 5/8 (1-200) был получен от Cell Signaling Technology, Inc. (Бостон, Массачусетс, США), а кроличий антимышиный периостин (1-100) был получен от Innovative Research (Нови, Мичиган, США).

Иммунофлуоресценция

Нижние челюсти мышей из контроля (WT и Het) и Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP фиксировали в 4% формальдегиде без РНКазы, деминерализовали в 15% EDTA без РНКазы в течение 1 недели (меняли каждый день). дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) в течение 30 мин и помещали в 30% сахарозу на ночь при 4 ° C.Нижние челюсти были серийно разрезаны в продольной плоскости 8 мкм с помощью криостата. Срезы тканей помещали на предметные стекла Superfrost (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США). Затем образцы инкубировали в блокирующем растворе, состоящем из 4% нормальной козьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 2% бычьего гамма-глобулина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 0,3% Triton X -100 (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США) в PBS в течение 60 мин перед инкубацией в течение 16 ч в первичных антителах кроличьи антимышиные Ki67, Ab15580 (1-50), кроличьи антимышиные α-SMA, Ab5694 (1∶ 50) и крысиные антитела против CD31 мыши, Ab7388 (1-50).Эти антитела были получены от Abcam Limited. Кроличья антимышиная расщепленная каспаза 3 (1-50) была получена от Cell Signaling Technology. Срезы промывали в PBS, а затем инкубировали в козьих антикроличьих антителах Alexa Fluor 568 и вторичных козьих антителах против крыс Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США) в разведении 1 × 100. Первичные и вторичные антитела разводили в блокирующем растворе. Предметные стекла промывали в PBS, воде, сушили на воздухе и покрывали флуоресцентным покрытием с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), и иммунореактивность визуализировали с помощью конфокального микроскопа в нашем Core Optical. Оборудование для визуализации (Olympus FV-1000 с четырьмя лазерами и ДИК; Olympus, Center Valley, PA, USA).Контрольные препараты состояли из соседних срезов, окрашенных точно так же, как экспериментальные срезы, за исключением того, что в них отсутствовали первичные антитела, а на некоторых предметных стеклах отсутствовали первичные и вторичные антитела.

Анализ мечения ник-концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP

Использовали набор для определения гибели клеток in situ , TMR красный (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США). Восьмимикронные залитые в парафин срезы контроля и Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP депарафинизировали в ксилоле и этаноле (абсолютные, 95%, 90%, 80% и 70%, разведенные в бидистиллированной воде), промывали в PBS. , обработанный протеиназой К, не содержащий нуклеаз (20 мкг · мл ^-1 в 10 ммоль · л ^-1 Трис-HCl, pH 7.5) в течение 30 мин и промыть PBS. Затем срезы инкубировали в реакционной смеси для мечения ник-концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL) (смесь раствора метки и раствора фермента) в течение 60 мин при 37 ° C во влажной атмосфере в темноте. Затем предметные стекла промывали в PBS (трижды по 5 минут каждое), покрывали флуоресцентным экраном с DAPI и оценивали под конфокальным микроскопом. В случае отрицательного контроля срезы обрабатывали раствором метки вместо реакционной смеси TUNEL.Для положительного контроля срезы обрабатывали ДНКазой 1, степени 1 (3000 U⋅mL ^-1 в 50 ммоль⋅L ^-1 Tris-HCl, pH 7,5, 1 мг⋅ мл ^-1 бычий сывороточный альбумин ) за 10 мин до обработки реакционной смесью TUNEL. Реакцию TUNEL визуализировали с помощью конфокального микроскопа.

Статистический анализ

Тест Стьюдента t и дисперсионный анализ были выполнены для сравнения данных между Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP и контрольными мышами их однопометников (WT и Het) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism и Microsoft Excel. P <0,05 считали статистически значимым. Для иммуноцитохимии оценивали по крайней мере два независимых помета для каждого антитела с двумя-тремя срезами на нижнюю челюсть от данного животного.

Результаты

Характеристика модели Sp7-Cre-EGFP и экспрессии в нижней челюсти

Используя модель мыши Sp7-Cre-EGFP и репортер Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato, мы картировали клетки внутри и вокруг структуры зубов, которые подверглись Cre-рекомбинации и развились в новые линии (отмечены выражением Red tdTomato).Следовательно, мы можем проследить за их потенциальным развитием в родословной. В наших первоначальных экспериментах мы использовали модель мыши Sp7-Cre-EGFP и репортер Rosa26-LSL-tdTomato, чтобы продемонстрировать наличие большого количества клеток Sp7 ⁺ (зеленые) в пульпе, одонтобластах и ​​остеобластах альвеолярных костей. постнатальный день 0 (P0), с большим количеством событий Cre (красный) в пульпе и в одонтобластном слое первого моляра. В точке P0 наблюдается небольшое количество клеток Sp7 ⁺ (события Cre) во втором моляре (дополнительные рисунки S1d и S1h).Дополнительный рисунок S1h также не показывает активности третьего моляра. В возрасте 2 недель наблюдается большое количество клеток Sp7 ⁺ в пульпе, пародонте и области апикального сосочка (зеленый). Многие из потомков (красный цвет), скорее всего, станут корневыми одонтобластами, цементобластами, остеобластами альвеолярной кости и / или фибробластами PDL (). На дополнительном рисунке S2 показана аналогичная картина в области коронки второго моляра в этом 2-недельном возрасте. Дополнительная фигура 3 показывает клетки Sp7 ⁺ и их потомство (красный цвет) в третьем моляре в возрасте 2 недель.Следует отметить, что не было клеток Sp7 ⁺ или событий Cre ни в одном из эпителиальных компонентов, включая все стадии амелогенеза либо в возрасте P0, либо в возрасте 2 недель на первом, втором или третьем молярах. Когда мы скрестили эту модель Sp7-Cre-EGFP с моделью Bmp2-floxed, мы обнаружили сложный фенотип, который включает нарушение формирования корня зуба и связанного с ним пародонта, а также амелогенез. ¹²

Исследования клонов путем картирования активности Cre в первом моляре постнатальных мышей нулевого дня с помощью конфокальной микроскопии с использованием Olympus FV 1000.Показаны комбинированных ядер, окрашенных DAPI (синий), клеток Sp7-Cre-EGFP ⁺ (зеленый) и tdTomato ⁺ (красный) (событие Cre). ( a ) Низкое увеличение первого и второго моляров с высокой активностью Cre в альвеолярной кости и первом моляре, но не обнаруживаемой активности Cre во втором моляре. ( b ) Sp7 ⁺ зеленый сигнал от EGFP. ( c ) Сигнал tdTomato, представляющий события Cre и ячейки, полученные из событий Cre (красный прямоугольник). ( d ) Показано при большом увеличении (× 400) области коронки первого моляра.Am, амелобласты; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; ДП, зубно-пульповая камера; Od, одонтобласты.

Исследования клонов путем картирования активности Cre в области корня второго моляра у двухнедельной мыши с помощью конфокальной микроскопии с использованием Olympus FV 1000. Комбинированные ядра, окрашенные DAPI (синие), Sp7-Cre-EGFP ^{Показаны ячейки +} (зеленый) и tdTomato ⁺ (красный). ( a ) Изображение DIC. ( b ) Sp7 ⁺ Сигнал EGFP. ( c ) Сигнал tdTomato, представляющий событие Cre и ячейки, полученные из событий Cre.AP — апикальный сосочек; БВ — кровеносный сосуд; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; ДИК — дифференциально-интерференционный контраст; Dp, зубно-пульповая камера; Od, одонтобласты; PDL, область периодонтальной связки.

Фенотип мышей Bmp2-cKO

^Sp7-Cre-EGFP в зубе и поддерживающих структурах

In, экспрессия экзона 3 Bmp2 снижена более чем на 85% в одонтобластах и ​​в субпопуляции клеток пульпы в молярах. Стрелки указывают на синий сигнал гибридизации. Зеленый цвет — это контрастное пятно метиленового зеленого.Обратите внимание на уменьшенное количество клеток пульпы зуба, гибридизующихся с зондом Bmp2 Exon 3, что указывает на делецию Bmp2 в подмножестве клеток Sp7 ⁺ в пульпе. Модель Sp7-Cre-EGFP эффективна при удалении экспрессии экзона 3 Bmp2, как показано и численно оценено. ⁶ Bmp2 Экзон 3 также удален в подмножестве клеток пародонта (). Экспрессия очень высока в ранних одонтобластах у контрольных мышей и снижается по мере завершения дентиногенеза к 1 месяцу (). В то время как экспрессия Bmp2 снижается через 4 дня и 2 недели по сравнению с контролем, экспрессия Bmp2 снижается через 1 месяц ( n = 2).Уровни фосфо-Smad1 / 5/8, считывание передачи сигналов Bmp, снижаются уже на E18 как в амелобластах, так и в одонтобластах первого моляра (). Это указывает на активность Cre уже на E18, и что Bmp2 в развивающихся одонтобластах косвенно влияет на передачу сигналов Bmp в эпителиальном амелобласте. ¹² Окрашенные гематоксилином и эозином срезы моляров мыши показывают сильный фенотип зубов уже через 4 дня на первом моляре (и). И одонтобласты, и амелобласты дисморфны и не могут дифференцироваться в сильно поляризованные структуры.

Ген Bmp2 удален как в одонтобласте, так и в области периодонтальной связки, а передача сигналов Bmp2 снижена как в одонтобластах, так и в амелобластах. ( a — d ) Bmp2 Exon 3 in situ гибридизация через 2 недели в пульпе зуба, одонтобласте и PDL. ( e , f ) Числовая оценка ⁶ через 4 дня, 2 недели и 1 месяц первых моляров нижней челюсти ( a — f ). Bmp2 Exon 3 уменьшается через 4 дня и 2 недели по сравнению с контролем (> 90%).Экспрессия Bmp2 обычно снижается по мере завершения терминальной дифференцировки и отмечается с небольшим изменением экспрессии экзона 3 Bmp2 через 1 месяц в первых молярах нижней челюсти. ( г , ч ) Иммуногистохимия Phospho-Smad1 / 5/8 в контроле и Bmp2-cKO ^Sp7Cre-EGFP первых моляров нижней челюсти у эмбрионов E18. ( i , j ) Окрашивание H&E первых моляров нижней челюсти у 4-дневных контрольных мышей и мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . Обратите внимание на начало тяжелого фенотипа зубов как в амелобластах, так и в одонтобластах.Am, амелобласты; Bmp2, костный морфогенетический белок-2; Dp, зубно-пульповая камера; H&E, гематоксилин и эозин; Od, одонтобласты; PDL, пародонтальная связка.

показывает анализ μCT контрольных мышей Het ^{Sp7-Cre-EGFP; Bmp2fx / +} (4A) и Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP (). Мы количественно определили общий объем дентина (), объем корневого дентина (), объем корневой пульпы (), объем эмали () и объем пародонта () в первом и втором молярах контрольных мышей и мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . в возрасте 1, 2 и 3 месяцев, объединение данных для всех трех возрастов для статистической оценки. Общий объем дентина уменьшился на 30-40% как на первом, так и на втором моляре (), а корневой дентин уменьшился на 50%. –80% ().Соответствующий объем корневой пульпы увеличивается примерно в три раза (). Как отмечено в, объем эмали уменьшается на 25% в первом моляре с аналогичной тенденцией во втором моляре. Объем пародонта значительно увеличивается до 30% на вторых молярах, с аналогичной тенденцией на первых молярах (). Дополнительный рисунок. S4 показывает аналогичные результаты в возрасте 6 недель как на первых, так и на вторых молярах. На рисунке рентгеновский анализ демонстрирует увеличенную камеру пульпы (синяя стрелка внутри) с неспособностью сформировать правильные корни () и более тонкий корневой дентин у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP в возрасте 1 () и 3 месяцев. () по сравнению с контрольными животными.Мы также заметили эктопические минерализованные области в пульпе возле апикальной области корня у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP , что было подтверждено гистологическим исследованием (синяя стрелка) в нижней челюсти 1,5-месячных мышей. . Материал выглядит как аномальный дентин с клетками внутри, похожими на кость, или остеодентин (OtD). Кроме того, у мышей Bmp2-cKO ^{Sp7-Cre — EGFP} клеточный внутренний волокнистый цемент (CIFC) значительно снижен, как показано (синяя стрелка), по сравнению с мышами.Однако никаких явных изменений в бесклеточном внешнем волокнистом цементе не наблюдалось (зеленая стрелка). Используя 3-месячные залитые пластиком нижние челюсти мыши в сочетании с кислотным травлением и сканирующей электронной микроскопией, мы отметили, что корни не были хорошо развиты, а CIFC был значительно снижен, как показано на (красная стрелка). Мы также подтвердили присутствие остеоденина (розовая стрелка внутри и обозначена как OtD). Кроме того, высота альвеолярной кости была уменьшена (красная полоса внутри), а дентинные канальцы были дефектными в отсутствие гена Bmp2 (синяя стрелка внутри).

μCT анализ нижней челюсти у контрольных мышей Het и Bmp2-cKO ^Sp7CreEGFP в возрасте 1 месяц, 2 месяца и 3 месяца. ( a , b ) Изображения всей нижней челюсти и образцы срезов до середины, показывающие примеры с этими 3-месячными данными различных компонентов, которые были количественно определены для всех возрастов как на первых, так и на вторых молярах. Первый коренной зуб, эмаль, розовая; корончатый дентин, желтый; коронная мякоть, зеленая; корневой дентин, пурпурный; корневая пульпа, ржавчина; пародонтальный объем, синий.Второй моляр, эмаль, голубой; корончатый дентин, желтый; корончатая мякоть, пурпурная; корневой дентин, светло-зеленый; корневая мякоть, красная; пародонт объемный, темно-синий. ( c , d ) Количественное определение общего объема дентина и объема корневого дентина в первом и втором молярах. ( e ) Количественное определение объема корневой пульпы (неминерализованной) в первом и втором молярах. ( f ) Количественное определение объема эмали первого и второго моляров. ( г ) Количественное определение объема пародонта на первом и втором молярах.** P <0,01, * P <0,05. Всего были определены 12 моляров, шесть контрольных моляров и шесть моляров Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP, первый и второй. Bmp2, костный морфогенетический белок-2.

Делеция гена Bmp2 в клетках Sp7 ⁺ (Osterix ⁺ ) приводит к потере корнеобразования, дисморфической дифференцировке одонтобластов и неспособности образовывать клеточный цемент. ( a — d ) Цифровые рентгеновские снимки контрольных и Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP нижней челюсти мыши через 1 месяц ( a и b ) и 3 месяца ( c и d ) с использованием рентгеновского излучения высокого разрешения Faxitron.Рентгеновский анализ демонстрирует увеличенную камеру пульпы (синие стрелки) с неспособностью сформировать правильные корни с более тонким корневым дентином (красные стрелки) в возрасте 1 и 3 месяцев Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP по сравнению с контрольными гетерозиготными животными . ( e — j ) Гистология 1,5-месячных контрольных мышей Het и Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . В e и h зеленые стрелки указывают на AEFC. g и j показывают CIFC, синяя стрелка и желтая стрелка указывают на аномальную минерализацию или OtD в камере пульпы корня, j — l показывают аномальное развитие корня зуба и образование цемента, что выявлено кислотным травлением пластмассы встроенные и СЭМ 3-месячных третьих моляров нижней челюсти от мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP по сравнению с контрольным WT.Красные полоски обозначают уровень образования альвеолярной кости между зубами и ширину пародонта. Низкое увеличение, красная стрелка и метка указывают на хорошо сформированный клеточный цемент в контрольной WT ( k ), но мало организованный клеточный цемент виден в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP (-1 ). Обратите внимание на OtD в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP (розовая стрелка в l ) у основания корней. ( m , n ) Большое увеличение области корня, показывающее нормальные дентинные канальцы в WT ( m ) и сильно дисморфные дентинные канальцы в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP ( n ).Зеленая рамка, область показана в e и h при большом увеличении. Синяя рамка, площадь показана в г и х при большом увеличении. Синяя рамка, область показана в м и n при большом увеличении. AEFC, бесклеточный цемент из внешних волокон; Bmp2, костный морфогенетический белок-2; CIFC, клеточный цемент с собственными волокнами; ОТД, остеодентин; СЭМ, растровый электронный микроскоп.

Sp7 является ключевым фактором транскрипции для образования CIFC ⁹ и образования корней и непосредственно регулирует коллаген, тип 1 и альфа 1 (Col1a1) в усилителе остеобластов и, возможно, напрямую регулирует дентин, сиалофосфопротеин и белок 1 матрикса дентина.Sp7 также напрямую регулирует VEGF через проксимальную область промотора. ¹³ Как показано на фиг.1, экспрессия мРНК протеина 1 матрикса дентина (), сиалофосфопротеина дентина (), Col1a1 () и Sp7 () значительно снижена на 80–95%, по данным численной оценки в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP животных (дополнительный рисунок S6). ⁶ Имеются наводящие на мысль данные, что Sp7 на самом деле может быть частью набора факторов транскрипции, который регулирует ядерный фактор IC (Nfic) и частью сети генов транскрипции с прямой связью.Поскольку Nfic является ключевым фактором транскрипции для формирования корня зуба и формирования пародонта, ^{14,15,16,17,18} мы провели гибридизацию in situ для экспрессии Nfic и экспрессии белка Nfic с помощью иммуноцитохимии (). Как показано на рисунке, мРНК Nfic снижается на 85% (дополнительный рисунок S6) в корневых одонтобластах этих первых моляров в возрасте 2 недель.

In situ гибридизации. ( a , b ) Dmp1; ( c , d ) Dspp; ( e , f ) Col1a1; ( г , ч ) Sp7; ( i , j ) Nfic в контроле и мыши Bmp2-cKO ^Sp7Cre-EGFP первых моляров нижней челюсти в возрасте 2 недель.Пруток = 20 мкм. Численная оценка изменений уровней этих ключевых факторов транскрипции, участвующих в формировании корня, и ключевых маркеров терминальной дифференцировки одонтобластов представлена ​​на дополнительном рисунке S6. Col1a1, коллаген, тип 1, альфа 1; Dmp1, белок 1 матрикса дентина; Dspp, сиалофосфопротеин дентина; Nfic, ядерный фактор IC; Od, одонтобласты.

Делеция гена Bmp2 в клетках Sp7 ⁺ (Osterix ⁺ ) приводит к дезорганизации пародонтальных связок, снижению экспрессии периостина и Nfic и снижению экспрессии VegfA в области пародонта и корневых одонтобластов. ( a , b ) краситель Ван Гизона для коллагеновых пучков и волокон контроля и Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP области пародонта, соответственно, при × 400. Желтая линия обозначает ширину пародонта. Черные стрелки — пучки волокон пародонтальной связки, богатых коллагеном типа 1 в пародонте, с дезорганизованными волокнами Шарпея у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . ( c , d ) Окрашивание коллагена пикросириусом красным показывает сильно дезорганизованные волокна Шарпея (белые стрелки) у мышей Bmp2-cKO ^{Sp7-Cre — EGFP} ( d ) по сравнению с контролем (). c ) при × 200.( e , f ) In situ гибридизация периостина при × 200. ( г , ч ) Иммуногистохимия периостина в контроле и Bmp2-cKO ^Sp7Cre-EGFP PDL при × 100. a — h получены от мышей в возрасте 1,5 месяца. ( i , j ) Иммуногистохимия Nfic в контроле и Bmp2-cKO ^Sp7Cre-EGFP вторых моляров при × 200. ( k , l ) Иммуногистохимия VEGF-A в контроле и Bmp2-cKO ^Sp7Cre-EGFP вторых моляров при × 200. i — l от месячных мышей, вторые моляры. Синяя стрелка указывает на пародонт, а фиолетовая стрелка указывает на корневые одонтобласты. Bmp2, костный морфогенетический белок-2; Nfic, ядерный фактор IC; VEGF, фактор роста эндотелия сосудов A.

Анализы пролиферации клеток и апоптоза в модели Bmp2-cKO

^Sp7-Cre-EGFP

Используя 2-недельные нижние челюсти в иммунофлуоресцентном анализе Ki67, мы не отмечаем серьезных изменений в индекс пролиферации между мышами WT и Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP , как показано на дополнительных рисунках S5a и S5b.По-видимому, наблюдается снижение апоптоза по данным анализа с расщепленным антителом к ​​каспазе 3 (дополнительный рисунок S5c и S5d) и анализа TUNEL вдоль участков одонтобласта дентина корня (дополнительный рисунок S5e и S5f) на вторых молярах Bmp2-cKO ^{Sp7-Cre. -EGFP} . Мы предполагаем, что это является отражением снижения гибели клеток микрососудистого русла, которое обычно исчезает после одонтогенеза и прекращения образования дентина, или что часть одонтобластов подвергается апоптозу, как и остеобласты, в то время как большинство одонтобластов становятся покоящимися одонтобластами или «одонтоцитами». и выполняет функции в ответах на нагрузку и ремонте.В модели Bmp2-cKO Sp7-Cre-EGFP мы имеем недостаточность или снижение терминальной дифференцировки одонтобластов, а также снижение васкуляризации в слое одонтобластов, и то и другое может привести к снижению наблюдаемого апоптоза в отсутствие Bmp2 . ген.

Кроме того, PDL дисморфны у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . Для дальнейшего изучения и подтверждения этих наблюдений за измененным пародонтом у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP мы выполнили окрашивание по Ван Гизону для пучков коллагеновых волокон.Как показано на примере 1,5-месячных мышей, у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP PDL были сильно дезорганизованы, а периодонтальное пространство увеличивалось (желтая полоса). Между коренными зубами также имеется небольшая альвеолярная кость для прикрепления PDL. Окрашивание пародонта красным пикрозиусом на коллаген в поляризованном свете () показывает сильно дезорганизованные волокна Шарпея у мышей Bmp2-cKO ^{Sp7-Cre — EGFP} () по сравнению с контролем (). Периостин — это белок внеклеточного матрикса, который высоко экспрессируется в периодонтальной связке.Как показано на фиг.3, наблюдается сниженная экспрессия мРНК периостина () и белка () в PDL у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP .

Возможный механизм действия Bmp2 на развитие зуба и опорной структуры

Ранее мы наблюдали, что удаление гена Bmp2 в зрелых одонтобластах привело к снижению васкуляризации пульпы. Это снижение васкуляризации было связано с уменьшением количества стволовых клеток-кандидатов, по крайней мере, одной нишей были капилляры и связанные с ними перициты в пульпе. ^6,19 Было показано, что количество фолликулярных стволовых клеток-кандидатов в пародонте уменьшается в модели условного нокаута Sp7. ⁹ Одним из косвенных механизмов, которые мы предлагаем, является снижение продукции VEGF-A индуцированными Bmp одонтобластами, клетками пульпы и / или другими клетками пародонта, а также предшественниками остеобластов, что приводит к изменениям в популяции стволовых клеток в сосудистых руслах и вокруг них. . ⁶ Как показано на фиг. И, наблюдается значительное снижение уровней белка VEGF-A в одонтобластах корня (фиолетовая стрелка), а также в периодонте (синяя стрелка) Bmp2-cKO ^{Sp7-Cre- EGFP} , а также мышей.

В костном мозге человека было ясно показано, что клетки CD146 ⁺ обладают всеми свойствами мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые могут дифференцироваться в функционирующие остеобласты и другие дифференцированные ткани, такие как хрящи и мышцы. ^20,21,22 Большинство этих клеток CD146 ⁺ связаны с мелкими кровеносными сосудами и обладают многими свойствами, которые некоторые называют перицитами. ²² Эти ассоциированные с сосудом клетки CD146 ⁺ были предложены в качестве стволовых клеток-кандидатов для одонтобластов, а также остеобластов. ²³ Предложенная гипотеза заключалась в том, что без образования правильных микрососудистых структур внутри зубов, частично за счет Bmp2-индуцированной продукции VEGF-A, будут снижены уровни этих кандидатов на МСК CD146 ⁺ . ^6,11 Как показано на фиг.1, CD146 высоко экспрессируется в структурах сосудов и микрососудов в пульпе (пурпурная стрелка) как третьего моляра (), так и резца () этих месячных животных, подвергающихся активному дентиногенезу. Также имеется большое количество микрососудов CD146 ⁺ в слое одонтобластов и рядом с ним, как показано на третьих молярах и резцах (соответственно) контрольных мышей.Мы показали значительное снижение CD146 ⁺ в микрососудистых структурах в слое одонтобластов (синяя стрелка) и пульпе (фиолетовая стрелка) у однопометных мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP .

Кандидат в маркер стволовых клеток CD146, связанный с мелкими кровеносными сосудами в слое одонтобластов, снижен в модели Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP , а стволовые клетки αSma ⁺ в шейной и апикальной областях пародонта уменьшаются. также значительно уменьшено в модели Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . ( a — d ) Маркер стволовых клеток-кандидатов иммуноцитохимии CD146, локализованный в пульпе зуба ( a — d , фиолетовые стрелки) и в ассоциации с кровеносными сосудами, прилегающими к слою одонтобластов ( a — d , синие стрелки) на капиллярах. Экспрессия белка CD146 значительно снижена в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP у месячных мышей (× 200). a и b от третьих моляров, а c и d от области шейной петли резца.Стволовые клетки-кандидаты, помеченные иммуноцитохимическим методом α-SMA, отмечены все в пародонте первого и второго моляров (данные показаны на дополнительном рисунке S7) и в менее развитых клетках зубных фолликулов третьих моляров ( e и f ). , черная стрелка) и области апикального сосочка ( g и h , черная стрелка). Экспрессия маркера стволовых клеток α-SMA значительно снижена у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP ( ч ) по сравнению с контролем ( г ), например, у второго моляра, возраст 1 месяц, и показано как × 200.Bmp2, костный морфогенетический белок-2.

Недавно с помощью процедур отслеживания клонов было показано, что клетки α-SMA ⁺ являются стволовыми клетками для остеобластов. Клетки ²⁴ Α-SMA ⁺ также показали высокую экспрессию как в зубном фолликуле, так и в области апикального сосочка. ²⁵ Наша гипотеза заключалась в том, что клетки α-SMA ⁺ в зубном фолликуле и области апикального сосочка могут быть кандидатами стволовых клеток для цемента, периодонтальных связок и остеобластов альвеолярной кости.Чтобы начать исследовать эту идею, мы провели иммуноцитохимию с антителом α-SMA и обнаружили, что клетки α-SMA ⁺ значительно уменьшены в зубном фолликуле у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP (черный стрелка) по сравнению с контролем (). Мы также отметили очень высокие уровни клеток α-SMA ⁺ в апикальной области сосочка (черная стрелка) по сравнению с Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP (черная стрелка). Считается, что апикальный сосочек содержит стволовые клетки одонтобластов корня и, возможно, стволовые клетки цементобластов, связанные с тканью микрососудов. ^26,27 Мы расширили эти результаты с помощью двойных иммунофлуоресцентных анализов с CD31-эндотелием (зеленый) и α-SMA ⁺ (красный), как показано на дополнительном рисунке S7. В области пародонта и апикального сосочка в контроле (дополнительный рисунок S7a, S7c и S7e) имеется большое количество красных клеток α-SMA ⁺ , локализующихся вокруг иммунного окрашивания CD31, в то время как уровни этих связанных с сосудами α- Клетки SMA ⁺ значительно уменьшены у мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP как в области перидонта и апикального сосочка, так и в сосудистых структурах в слое одонтобласта (дополнительные рисунки S7b, S7d и S7f).

Обсуждение

Мы обнаружили новые и уникальные роли гена Bmp2 как в развитии пародонта, так и в корне зуба, которые у постнатальных животных кажутся скоординированными. Существуют прямые автономные клеточные эффекты на терминальную дифференцировку одонтобластов, а также дифференцировку клеток-предшественников в компоненты пародонта. Кроме того, дифференцировка эмали и амелобластов была изменена непрямым образом, поскольку не было экспрессии Sp7-Cre-EGFP ни в одной из клонов амелобласт-эпителий, как показывает анализ клонов.Развитие коренных корней было навсегда изменено в Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP . Механизм фенотипа корня зуба и цемента связан с нарушением терминальной дифференцировки, что косвенно приводит к уменьшению количества стволовых клеток-кандидатов, которые представляют собой CD146 ⁺ в пульпе зуба, а также уменьшаются в периодонте и области апикального сосочка, которые являются α- SMA ⁺ . Считается, что взаимосвязь этих фенотипов связана со снижением васкуляризации в результате снижения Bmp2-зависимой продукции VEGF-A и других факторов, участвующих в васкуляризации и ангиогенезе в пульпе, слое одонтобластов и пародонте. ⁶ Недавние данные показали с помощью исследований по отслеживанию клонов, что в контексте костного мозга клетки α-SMA ⁺ являются предшественниками остеобластов, а клетки α-SMA ⁺ в пародонте обладают высокой способностью образовывать минерализующие структуры, похожие на кость и цемент. ^24,25

α-SMA ⁺ клетки обнаруживаются не только на многих гладкомышечных клетках более крупных кровеносных сосудов, но также на более мелких микрососудах или стенках капилляров, иногда называемых перицитами.Клетки α-SMA ⁺ также разбросаны по всему слою одонтобластов и в области пульпы, не обязательно по микрососудам, и высоко экспрессируются в пародонте. ²⁵ Последние данные с использованием модели резцов и маркера NG2 для перицитов, Feng et al. , ¹⁹ показали, что часть этих перицитов может фактически становиться одонтобластами с помощью процедур отслеживания клонов. Кроме того, неперицитная ниша для одонтобластов также была идентифицирована в области петли шейки матки, но все же в области с высокой степенью васкуляризации. ¹⁹ Таким образом, кажется, что существует несколько ниш для стволовых клеток даже в области пульпы; Локализация этих ниш МСК не была исследована в контексте развивающихся моляров. Мы предлагаем клетки α-SMA ⁺ , по крайней мере, подмножество, являются стволовыми клетками для одонтобластов и для других компонентов поддерживающих структур зубов, таких как цементобласты, фибробласты PDL и остеобласты альвеолярной кости. Наша гипотеза состоит в том, что ген Bmp2 имеет решающее значение для развития зуба и корней зубов в координации с формированием опорных структур зуба.

Мы также отметили массивный остеодентин в пульпе мышей Bmp2-cKO ^Sp7-Cre-EGFP , что свидетельствует об изменениях и клеточно-автономной дисморфической дифференцировке одонтобластов. Недавние данные показали, что условное удаление индуцированного Bmp2 фактора транскрипции, Sp7, приводит к серьезным дефектам цементогенеза. ⁹ Фактор транскрипции Sp7 высоко экспрессируется в подмножестве клеток пульпы зуба, одонтобластах, цементобластах и ​​подмножестве клеток зубных фолликулов в пародонте, как продемонстрировано и опубликовано с использованием модели условных KO мышей Sp7. ⁹ Когда ген Bmp2 удален в этих нескольких типах или состояниях клеток, мы показали серьезные дефекты в формировании корня зуба, а также в цементе, PDL и формировании альвеолярной кости. Основной механизм, по-видимому, частично связан с неспособностью сформировать сосудистую систему в пульпе зуба и в периодонте в отсутствие гена Bmp2 в предшественниках одонтобластов и пародонта. Поскольку в настоящее время существует множество примеров связи васкуляризации и связанных стволовых клеток на стенках сосудов, и что существует сильная корреляция образования кровеносных сосудов и образования остеобластов, мы выдвинули гипотезу, что этот принцип применим ко многим из них. стволовые клетки пульпы зуба и пародонта. ^6,7,28,29 Подтверждающие доказательства этой гипотезы представлены уменьшением количества стволовых клеток-кандидатов CD146 ⁺ на малых микрососудах в пульпе зуба и снижением продукции VEGF-A, когда ген Bmp2 является снято с Sp7 ⁺ ячеек. Было показано, что сверхэкспрессия VEGF-A в костном микроокружении вызывает массивную новую васкуляризацию и образование новой кости. ³⁰

Другим основным кандидатом в маркеры МСК в периодонте и пульпе зуба является антиген α-SMA.Было показано, что эти α-SMA ⁺ клетки обладают свойствами МСК по нескольким критериям. ^24,31 Мы показали значительное снижение экспрессии клеток α-SMA ⁺ как в области пульпы зуба, так и в периодонте в отсутствие гена Bmp2 .