Обязательные (О)/ Рекомендуемые (Р) | Марка, модель автомобиля | Мощность двигателя, kW | Линейная норма, л/100 км, куб.м/100 км |
О | АРО-243 (дв. ЗМЗ-24) | — | 16,2 Б |
О | АРО-244 (дв. D-127) | 70 | 7,7 Д |
О | ВАЗ-1111 (дв. ВАЗ-1111) | — | 6,5 Б |
О | ВАЗ-11173 1,6i (дв. ВАЗ-21114, -21124) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-11174-110-30 (дв. ВАЗ-11194, 1,4i) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-11183, -11183-210-20, -11183-110-20, -11183-110-30 (дв. ВАЗ-21114, -21114-50) | — | 7,5 Б |
8,9 СУГ | |||
О | ВАЗ-11184 (дв. ВАЗ-11194, 1,4i) | — | 7,0 Б |
О | ВАЗ-11193-110-20 (дв. ВАЗ-21114, 1,6i) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-11194 (дв. ВАЗ-11194) | — | 7,0 Б |
О | ВАЗ-2101 (дв. ВАЗ-2105) | — | 9,7 СУГ |
О | ВАЗ-2101, -21011, -21013, -21016, -2102, -21021, -21023, -21033, -21035, -2104, -2105, -21051, -21063, -21072 (дв. ВАЗ-2101, -21011) | — | 8,1 Б |
О | ВАЗ-2103, -21043, -21053, -21061, -2107, -2110 (дв. ВАЗ-2103, -2105) | — | 8,3 Б |
Р | ВАЗ-2104 (дв. ВАЗ-21214) | — | 8,3 Б |
О | ВАЗ-21041-20, -030, -282-20 (дв. ВАЗ-21067, 1,6i) | — | 7,9 Б |
9,0 СУГ | |||
О | ВАЗ-21043 (дв. ВАЗ-2103) | — | 9,9 СУГ |
О | ВАЗ-21044 (дв. ВАЗ-21073) | — | 8,4 Б |
О | ВАЗ-21045 (дв. ВАЗ 341 Барнаул) | — | 6,2 Д |
О | ВАЗ-2105 (дв. ВАЗ-2106) | — | 8,7 Б |
О | ВАЗ-21053 (дв. ВАЗ-2103) | — | 11,4 СУГ |
О | ВАЗ-21053, -2106, -21063, -21074 (дв. ВАЗ-2105, -2106) | — | 8,7 Б |
О | ВАЗ-2106 (дв. ВАЗ-2106) | — | 9,0 СПГ 11,8 СУГ |
O | ВАЗ-21061 (дв. ВАЗ-2103) | — | 8,7 Б |
О | ВАЗ-21061 (дв. ВАЗ-2103) | — | 11,4 СУГ |
О | ВАЗ-21062 (дв. ВАЗ-2103) | — | 8,5 Б |
О | ВАЗ-21063 (дв. ВАЗ-2105) | — | 9,3 СУГ |
О | ВАЗ-21065 (дв. ВАЗ-2103) | — | 8,3 Б |
9,9 СУГ | |||
О | ВАЗ-21065 (дв. ВАЗ-2106) | — | 8,3 Б |
О | ВАЗ-2107 (дв. ВАЗ-2103) | — | 8,3 Б |
9,9 СУГ | |||
О | ВАЗ-2107, -045-01 (дв. ВАЗ-2104, 1,5i) | — | 7,9 Б |
О | ВАЗ-21070, -110, -120-20 1,5i (дв. ВАЗ-2104) | — | 7,9 Б |
О | ВАЗ-21070-120-21 1,5i (дв. ВАЗ-2104) | — | 7,9 Б |
9,1 СУГ | |||
О | ВАЗ-21073 (дв. ВАЗ-2106) | — | 8,7 Б |
О | ВАЗ-21073 (дв. ВАЗ-21073) | — | 9,4 Б |
О | ВАЗ-21074 (дв. ВАЗ-2103) | — | 9,9 СУГ |
О | ВАЗ-21074 (дв. ВАЗ-2106) | — | 10,1 СУГ |
О | ВАЗ-21074 1,6i (дв. ВАЗ-21067) | — | 7,9 Б |
О | ВАЗ-2108, -2109 (дв. ВАЗ-2108) | — | 7,6 Б |
О | ВАЗ-21081, -21091 (дв. ВАЗ-21081) | — | 7,6 Б |
О | ВАЗ-21083, -21093, -21093-02, -21093-03, -21099 (дв. ВАЗ-21083) | — | 7,8 Б |
О | ВАЗ-2109 (дв. ВАЗ-2108) | — | 8,9 СУГ |
О | ВАЗ-21093 (дв. ВАЗ-2111) | — | 7,8 Б |
О | ВАЗ-21099 (дв. ВАЗ-21083) | — | 10,9 СУГ |
О | ВАЗ-21099 (дв. ВАЗ-2111) | — | 7,9 Б |
9,0 СУГ | |||
О | ВАЗ-21100 (дв. ВАЗ-21083) | — | 7,9 Б |
9,5 СУГ | |||
О | ВАЗ-21101, -21101-01, -21101-110-01 (дв. ВАЗ-21114, 1,6i) | — | 7,5 Б |
8,6 СУГ | |||
О | ВАЗ-21102 (дв. ВАЗ-2111) | — | 7,7 Б |
8,8 СУГ | |||
О | ВАЗ-21103 (дв. ВАЗ-2112) | — | 8,2 Б |
О | ВАЗ-21104, -21104-01, -21104-02, -21104-126-52 (дв. ВАЗ-2112, -21124) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-21108 (дв. ВАЗ-21128) | — | 7,6 Б |
О | ВАЗ-2111, -21110 (дв. ВАЗ-21083, -21083-80) | — | 8,0 Б |
О | ВАЗ-21110 (дв. ВАЗ-2111) | — | 8,8 СУГ |
О | ВАЗ-21112, -21112-01, -21112-125-51 (дв. ВАЗ-21114, 2111) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-21113 (дв. ВАЗ-2112) | — | 8,2 Б |
О | ВАЗ-21114, -21114-01, -21114-02, -21114-125-52, -21114-110-02 (дв. ВАЗ-21124) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-21120 (дв. ВАЗ-2112) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-21121, -21121-01, -21121-110-01 (дв. ВАЗ-21114) | — | 7,5 Б |
О | ВАЗ-21122 (дв. ВАЗ-2111) | — | 7,9 Б |
О | ВАЗ-21124, -21124-02 (дв. ВАЗ-21124, -2112) | — | 7,5 Б |
8,6 СУГ | |||
О | ВАЗ-21140 1,5i (дв. ВАЗ-21083) | — | 7,9 Б |
О | ВАЗ-2114-110-22, -21140, -21144, -21144- 110-20 (дв. ВАЗ-11183, -2111, 1,6i) | — | 7,6 Б |
О | ВАЗ-21150, -21150-20 (дв. ВАЗ-21083, -2111, 1,5i) | — | 7,9 Б |
9,0 СУГ | |||
О | ВАЗ-2115-20 (дв. ВАЗ-2111) | — | 7,9 Б |
О | ВАЗ-21154, -21154-110-20, -21154-110-22 (дв. ВАЗ-11183, 1,6i) | — | 7,6 Б |
О | ВАЗ-2120, -21212 (дв. ВАЗ-2130) 4WD | — | 12,1 Б |
12,3 СПГ | |||
О | ВАЗ-2121 «Нива», -21211 (дв. ВАЗ-2121) 4WD | — | 11,6 Б |
О | ВАЗ-21213 (дв. ВАЗ-2107) 4WD | — | 11,6 Б |
12,9 СУГ | |||
О | ВАЗ-21213 (дв. ВАЗ-21213, 1,7i) 4WD | — | 12,9 СУГ |
О | ВАЗ-21213 (дв. ВАЗ-21213) 4WD | — | 11,6 Б |
О | ВАЗ-21214, -21214-126-20 (дв. ВАЗ-21214-10, 1,7i) 4WD | — | 11,6 Б |
13,1 СУГ | |||
О | ВАЗ-2123 (дв. ВАЗ-2123) 4WD | — | 10,5 СУГ |
О | ВАЗ-2131, -21310 (дв. ВАЗ-2130) 4WD | — | 12,4 Б |
12,4 СПГ 14,0 СУГ | |||
О | ВАЗ-2131, -21310, -21310-120 (дв. ВАЗ-21214, 1,7i) 4WD | — | 11,6 Б |
13,3 СУГ | |||
О | ВАЗ-21310 (дв. ВАЗ-21213) 4WD | — | 11,6 Б |
О | ВАЗ-21312 (дв. ВАЗ-2130) 4WD | — | 12,1 Б |
О | ВАЗ (LADA) -21703, -21703-110-01 (дв. ВАЗ-21126, 1,6i) | — | 8,1 Б |
O | ВАЗ (LADA) -21713, -110, -118 (дв. ВАЗ-21126, 1,6i) | — | 8,5 Б |
Р | ВАЗ (LADA) -217130, -110, -118 (дв. ВАЗ-21126, l,6i) | — | 8,5 Б |
Р | ВАЗ (LADA) -21900, -113-41, -116-41 «Granta» (дв. ВАЗ-21116, l,6i) | — | 8,0 Б |
Р | ВАЗ (LADA) -21901, -110-40, -110-41 «Granta» (дв. ВАЗ-11183, l,6i) | — | 7,8 Б |
Р | ВАЗ (LADA) -21906, -110-40, -110-41 «Granta» (дв.ВАЗ-11183, l,6i) | — | 7,8 Б |
О | ВАЗ-21723 1,6i (дв. ВАЗ-21126) | — | 8,5 Б |
Р | ВАЗ(LADA)-21723 (дв. ВАЗ-21126, 1,6i) | — | 8,5 Б |
О | ГАЗ-13 (дв. ЗМЗ-13) | — | 19,0 Б |
О | ГАЗ-14 (дв. ЗМЗ-14) | — | 20,9 Б |
О | ГАЗ-2217 «Баргузин» (дв. ЗМЗ-40522) | — | 12,5 Б |
О | ГАЗ-2217 «Баргузин» (дв. ЗМЗ-40630) | — | 14,2 Б |
О | ГАЗ-2217 (дв. Chrysler 2,4L) | — | 12,0 Б |
О | ГАЗ-2217 (дв. ГАЗ-560) | — | 10,3 Д |
О | ГАЗ-2217 (дв. ЗМЗ-40522А) | — | 14,3 СУГ |
О | ГАЗ-2217 (дв. ЗМЗ-405240) | — | 12,5 Б |
О | ГАЗ-2217 (дв. ЗМЗ-4063OD) | — | 13,4 Б |
16,1 СУГ | |||
Р | ГАЗ-2217, -288 «Бизнес» (дв. УМЗ-421600) | — | 13,2 Б |
О | ГАЗ-2217, -22171, -22171-404 (дв. ЗМЗ-405220, -40522, -40522А, -40522P, -40522R, -40522S, -40522T) | — | 12,5 Б |
О | ГАЗ-22171 (дв. Chrysler 2,4L) | — | 12,0 Б |
О | ГАЗ-22171 (дв. ГАЗ-560) | — | 10,3 Б |
О | ГАЗ-22171 (дв. ЗМЗ-4063ОC, -4063.10) | — | 14,8 Б |
О | ГАЗ-22171 (дв. ЗМЗ-4063ОD) | — | 14,6 Б |
О | ГАЗ-2217-104 «Баргузин» (дв. ЗМЗ-40630) | — | 14,8 Б |
16,6 СУГ | |||
О | ГАЗ-22171, -288 «Бизнес» (дв. УМЗ-421600) | — | 13,5 Б |
О | ГАЗ-2217, -288 «Бизнес» (дв. УМЗ-421600) | — | 13,5 Б |
О | ГАЗ-24, -24-01, -24-02, -24-04, -24Т | — | 12,4 Б |
О | ГАЗ-24-01М | — | 12,2 Б |
О | ГАЗ-24-03 | — | 12,8 Б |
О | ГАЗ-24-07, -24-25 | — | 15,7 СУГ |
О | ГАЗ-24-10 | — | 11,7 Б |
О | ГАЗ-2410 (дв. ЗМЗ-402) | — | 14,6 СУГ |
О | ГАЗ-24-11 | — | 12,1 Б |
О | ГАЗ-24-12, -24-13 (дв. ЗМЗ-402, -402.10) | — | 12,8 Б |
О | ГАЗ-24-12, -24-13 (дв. ЗМЗ 4021, -4021.10) | — | 13,3 Б |
О | ГАЗ-24-14 | — | 12,8 Б |
О | ГАЗ-24-17 | — | 17,1 СУГ |
О | ГАЗ-24-60 | — | 12,4 Б |
Р | ГАЗ-2434 (дв. ЗМЗ-4062) | — | 9,9 Б |
О | ГАЗ-3102 (дв. Chrysler 2,4L) | — | 10,0 Б |
О | ГАЗ-3102 (дв. Rover 20T4) | 100 | 9,2 Б |
О | ГАЗ-3102 (дв. Toyota, 3,4i) | 162 | 11,9 Б |
О | ГАЗ-3102 (дв. ЗМЗ-402) | — | 12,5 Б |
14,8 СУГ | |||
О | ГАЗ-3102 (дв. ЗМЗ-4020ОМ) | — | 12,5 Б |
О | ГАЗ-3102 (дв. ЗМЗ-4021) | — | 12,3 Б |
О | ГАЗ-3102 (дв. ЗМЗ-4022.10) | — | 13,3 Б |
О | ГАЗ-3102 (дв. ЗМЗ-40621A) | — | 9,9 Б |
О | ГАЗ-3102 2,0i (дв. Rover 20T4H958) | — | 10,1 Б |
О | ГАЗ-3102, -121 (дв. ЗМЗ-4062; -4062OD) | — | 9,9 Б |
О | ГАЗ-31022, -310221 (дв. ЗМЗ-402) | — | 12,7 Б |
О | ГАЗ-310221 (дв. ЗМЗ-40621А) | — | 9,9 Б |
О | ГАЗ-310221-441 (дв. ЗМЗ 4021) | — | 13,0 Б |
O | ГАЗ-310221, -590 (дв. Chrysler 2,4L) | — | 10,6 Б |
О | ГАЗ-31029 (дв.24Д/24-01) | — | 16,3 СУГ |
О | ГАЗ-31029 (дв. ЗМЗ-402, -402.10) | — | 12,1 Б |
12,7 СПГ 13,3 СУГ | |||
О | ГАЗ-31029 (дв. ЗМЗ-4021) | — | 12,3 Б |
12,5 СПГ 13,5 СУГ | |||
О | ГАЗ-3110 (дв. Toyota 5L-T) | — | 9,0 Д |
О | ГАЗ-3110 (дв. ГАЗ-560) | — | 8,7 Д |
О | ГАЗ-3110 (дв. ЗМЗ-402, -4020ОМ, -4021) | — | 12,2 Б |
О | ГАЗ-3110 (дв. ЗМЗ-4022.10, -4026.10) | — | 12,4 Б |
О | ГАЗ-3110 (дв. ЗМЗ-4063ОА) | — | 10,0 Б |
О | ГАЗ-3110, -3110-101, -311001 (дв. ЗМЗ-4062, -4062ОD, -4062OF) | — | 9,9 Б |
12,1 СУГ | |||
О | ГАЗ-3110-305 (дв. ЗМЗ-4020ОМ) | — | 12,2 Б |
О | ГАЗ-31105 (дв. ЗМЗ-4021, -4021ОD) | — | 10,9 Б |
О | ГАЗ-31105 (дв. ЗМЗ-405240) | — | 10,0 Б |
О | ГАЗ-31105 (дв. ЗМЗ-40621, -40621A) | — | 9,9 Б |
О | ГАЗ-31105 2,7i (дв. Toyota 3RZ-FE) | 110 | 10,3 Б |
О | ГАЗ-31105, -31105-120 (дв. ЗМЗ-4062, -4062OD) | — | 9,9 Б |
12,1 СУГ | |||
О | ГАЗ-31105, -31105-120, -31105-583, -31105-593 (дв. Chrysler 2,4L) | — | 10,0 Б |
11,9 СУГ | |||
О | ГАЗ-31105-501 (дв. Chrysler, 2,4i) | — | 10,0 Б |
О | ГАЗ-31105-801 (дв. ЗМЗ-40621H) | — | 10,1 Б |
О | ГАЗ-31113 (дв. ЗМЗ-405) | — | 11,9 Б |
О | ГАЗ-3221 (дв. ГАЗ-560) | — | 10,2 Д |
О | ГАЗ-3221 (дв. ЗМЗ-405220, -40522А) | — | 13,0 Б |
О | ГАЗ-3221 (дв. ЗМЗ-40630А) | — | 15,2 Б |
18,0 СУГ | |||
О | ГАЗ-3221 (дв. УМЗ-4215С) | — | 16,2 Б |
О | ГАЗ-3221, -322100 (дв. ЗМЗ-402.10, -4026, -4026OF) | — | 15,5 Б |
17,6 СУГ | |||
О | ГАЗ-3221, -404 (дв. ЗМЗ-405240) | — | 13,0 Б |
О | ГАЗ-322100 (дв. ЗМЗ-4025.10) | — | 15,8 Б |
О | ГАЗ-322114 (дв. ЗМЗ-4063ОА) | — | 15,2 Б |
О | ГАЗ-3221, -288 «Бизнес» (дв. УМЗ-421600) | — | 14,2 Б |
О | ГАЗ-322132 (дв. ЗМЗ-4063, -4063ОА) | — | 15,2 Б |
18,5 СУГ | |||
O | ГАЗ-322132 «Юникс-3561» (дв. УМЗ-421600) с гидроподъемником | — | 16,0 Б |
Р | ГАЗ-322132 «Юникс-3561» (дв. УМЗ-421600) «Бизнес» с гидроподъемником | — | 15,5 Б |
О | ГАЗ-32217 (дв. 406.30А) | — | 15,8 Б |
О | ГАЗ-3262 (дв. УМЗ-4215) | — | 16,2 Б |
О | ЗИЛ-114 | — | 22,8 Б |
О | ЗИЛ-117 | — | 21,9 Б |
О | ЗИЛ-4104 | — | 24,7 Б |
О | ИЖ-2126 (дв. УМЗ-331) | — | 9,8 Б |
О | ИЖ-2126 (дв. УМЗ-412-7) | — | 8,6 Б |
О | ИЖ-2126-030 (дв. ВАЗ-2106) | — | 8,6 Б |
О | Люблин 3314 (дв. 4CTi90-1BE6) | 66 | 11,3 Д |
О | М-2141201 (дв. УМЗ-331) | — | 10,5 Б |
О | М-21412-01 2,0 (дв. Renault) | — | 10,6 Б |
О | МЗМА-2141 (дв. УМЗ-3313) | — | 10,0 Б |
О | МЗМА-412 (дв.412Э) | — | 13,1 СУГ |
О | Москвич-2141 (дв. Ford 1,8D) | — | 7,4 Д |
О | Москвич-2141 (дв. УМЗ-3317) | — | 10,7 СУГ |
О | Москвич-2141-2-01 1,7 (дв. УМЗ-3317) | — | 9,8 Б |
О | Москвич-214136 (дв. УМЗ-331) | — | 11,2 СУГ |
О | Москвич-412 1,7 (дв. УМПО-3317) | — | 9,9 Б |
О | Москвич-412, -412ИПЭ, -412ИЭ, -412М, -412П, -412ПЮ, -412Э, -412Ю, -423, -423Н, -423Т, -423Э, -424, -424СЭ, -424Э, -424Т, -424Ю, -426, -426ИЭ, -426Т, -427, -427ИЭ, -2136, -2137, -2138, -21381, -2140, -21401, -21403, -21406, -427ИЭ, -2125, -21251, -2141, -21412 | — | 9,5 Б |
О | СЕАЗ-11113 (дв. ВАЗ-11113) | — | 5,2 Б |
О | УАЗ-22069-04 (дв. УМЗ-4218ОА) 4WD | — | 16,3 Б |
О | УАЗ-220692-04 (дв. ЗМЗ-410400) 4WD | — | 15,5 Б |
О | УАЗ-220694-04 (дв. УМЗ-4213ОН) 4WD | — | 15,0 Б |
О | УАЗ-3151 (дв. ЗМЗ-402.1) 4WD | — | 15,0 СПГ |
O | УАЗ-315101 (дв. УМЗ-414) 4WD | — | 16,0 Б |
О | УАЗ-31512 (дв. ЗМЗ-402) 4WD | — | 17,5 СУГ |
О | УАЗ-31512, -01 (дв. УМЗ-4178) 4WD | — | 15,2 Б |
17,3 СУГ | |||
О | УАЗ-31512 (дв. УМЗ-4178OB) 4WD | — | 15,2 Б |
О | УАЗ-31512 (дв. УМЗ-4218.10) 4WD | — | 15,0 Б |
О | УАЗ-31514 (дв. ЗМЗ-40210) 4WD | — | 14,8 Б |
О | УАЗ-31514 (дв. ЗМЗ-403) 4WD | — | 15,2 Б |
О | УАЗ-31514 (дв. УМЗ-4178) 4WD | — | 15,7 Б |
О | УАЗ-31514 (дв. УМЗ-4218.10) 4WD | — | 15,0 Б |
О | УАЗ-31514 3 2,4TD 4WD | 63 | 9,3 Д |
О | УАЗ-315142-012 (дв. ЗМЗ-4021OL) 4WD | — | 14,8 Б |
О | УАЗ-315143-095 (дв. 4Ct 90-1ME) 4WD | — | 9,3 Д |
О | УАЗ-315148-053, -095 (дв. ЗМЗ-5143, -5143.10) 4WD | — | 9,6 Д |
О | УАЗ-31519 (дв. ОМ-616) 4WD | 55 | 10,7 Д |
О | УАЗ-31519 (дв. УМЗ-4178ОВ) 4WD | — | 14,3 Б |
О | УАЗ-31519, -017, -095-01 (дв. УМЗ-4218, -4218ОА) 4WD | — | 15,0 Б |
15,2 СПГ | |||
О | УАЗ-315195, -030 (дв. ЗМЗ-4090OJ, -409.00U, -409.10) 4WD | — | 13,7 Б |
16,2 СУГ | |||
О | УАЗ-3153 (дв. УМЗ-4218) 4WD | — | 14,3 Б |
О | УАЗ-31601 (дв. УМЗ-421.10-10) 4WD | — | 16,1 Б |
О | УАЗ-31602 (дв. ЗМЗ-409) 4WD | — | 14,4 Б |
О | УАЗ-31605 (дв. УМЗ-421300) 4WD | — | 14,3 Б |
О | УАЗ-31622 2,7i (дв. ЗМЗ-409) 4WD | — | 14,3 Б |
О | УАЗ-31625 (дв. УМЗ 4215) 4WD | — | 17,3 Б |
О | УАЗ-3163, -010, -020, -030, -118, -230, -337, -340 (дв. ЗМЗ-4090OR, -4090OW, -409040) 4WD | — | 12,5 Б |
12,9 СПГ | |||
O | УАЗ-3163-233 (дв. ЗМЗ-409.04) 4WD | — | 13,2 Б |
O | УАЗ-31631-225, -335 2,3Hpi (дв. Iveco F1A) 4WD | 85 | 11,4 Д |
О | УАЗ-31631-332 2,3Hpi (дв. Iveco F1A, 85 kW) 4WD | — | 10,8 Д |
О | УАЗ-390994 (дв. УМЗ-4213ОН) 4WD | — | 14,3 Б |
О | УАЗ-3962 (дв. УМЗ-417-809, -4178) 4WD | — | 16,8 Б 20,0 СУГ |
О | УАЗ-39629 (дв. УМЗ-4218) 4WD | — | 17,7 Б 21,9 СУГ |
О | УАЗ-396294-016 (дв. УМЗ-4213ОН) 4WD | — | 14,3 Б |
О | УАЗ-469 2,9 (дв. УМЗ-4218.10) 4WD | — | 17,1 Б |
211141008080 Прокладка ВАЗ-21114 (1.6 I) 8 кл. коллектора выпускного БЦМ — 21114-1008080 21114100808000
211141008080 Прокладка ВАЗ-21114 (1.6 I) 8 кл. коллектора выпускного БЦМ — 21114-1008080 21114100808000 — фото, цена, описание, применимость. Купить в интернет-магазине AvtoAll.Ru
Распечатать
30
1
Применяется: ВАЗ
Артикул:
21114-1008080еще, артикулы доп.: 21114100808000скрыть
Код для заказа: 127544
Есть в наличии
Доступно для заказа — >10 шт.Данные обновлены: 24.07.2021 в 04:30
Код для заказа
127544
Артикулы
21114-1008080, 21114100808000
Производитель
БЦМ
Каталожная группа:
..Двигатель
Двигатель
Ширина, м:
0.1
Высота, м:
0.004
Длина, м:
0.37
Вес, кг:
0.124
Отзывы о товаре
Где применяется
Сертификаты
Обзоры
Наличие товара на складах и в магазинах, а также цена товара указана на 24.07.2021 04:30.
Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час.
При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.
Интернет-цена — действительна при заказе на сайте или через оператора call-центра по телефону
8-800-600-69-66. При условии достаточного количества товара в момент заказа.
Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.
Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.
Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.
c5955ac75c651798c35971b3ffbb7b1e
Добавление в корзину
Код для заказа:
Доступно для заказа:
Кратность для заказа:
Добавить
Отменить
Товар успешно добавлен в корзину
!
В вашей корзине
на сумму
Закрыть
Оформить заказ
Технические характеристики автомобиля Lada (ВАЗ) 21114 (1998)
Технические характеристики Lada (ВАЗ) 21114
Первый переднеприводный универсал от ВАЗ, сохранивший в себе все особенности и удобства «десятого» седана. Отличается от всех предыдущих моделей задним сиденьем, которое можно складывать для перевозки груза по частям. В этой машине, есть две уникальные системы — САУО и БСК. Первая (система автоматического управления с отопителем) в автоматическом режиме прогревает салон, поддерживая заданную температуру, вторая (бортовая система контроля) следит за уровнями технических жидкостей, состоянием тормозных колодок, исправностью лампочек в системе наружного освещения и даже за правильностью закрывания дверей, оповещая водителя о неисправности специальными сигналами.
Автомобильный каталог содержит описание, технические характеристики и фотографии автомобиля Lada (ВАЗ) 21114.
Продажа подержанных автомобилей Lada (ВАЗ) 2111
Отзывы владельцев автомобиля Lada (ВАЗ)
-
28.09.2007
Мациевский Денис Сергеевич
Оценка автора
Объективность
Ваз 11183 (Клина). Пробег на сегодняшний день 4050 км, машина у меня с 7 августа 2007 г.
Брал в автосалоне «Курск-Лада».
***
Начну с салона.
Пришел в салон 4 августа за 30 минут до закрытия, менеджер сразу повел меня на площадку выбирать машину, изночально хотелось хэтчбэк аспарагус (салатовый) или рислинг (серебристый). Аспаругуса не было совсем, а рислинг было всего две машины — седан и хэтчбэк. Этим мой выбор закончился. Касса была уже закрыта, предоплату оставить нельзя. В машину положили записку, что типа машина зарезервирована. С утра 5 августа принес 20 000 тыс…
подробнее -
11.07.2010
IPs_11072010
Оценка автора
Объективность
Купил годовалой у знакомого, на одометре было 11000, за пол года стало 19000. За это время порвалась трубка подачи воды на омыватель заднего стекла, натянул ремень генератора, поменял разбитую противотуманку, поменял пыльник на коробке. Двигателя для пустой машины более чем достаточно, а вот 5 человек и полный багажник уже чувствуется, хотя и при такой загрузке по хорошей дороге 130-140 нормально едет, хотя разгоняется уже вяло… Пустым ездил 175, нареканий нет. Багажник супер, со сложеными сиденьями можно свободно спать на природе или возить габаритные вещи. Замечаний ил…
подробнее -
21.09.2007
Nefr_05092007
Оценка автора
Объективность
Хорошее соотношение цены и качества!!!!!!!!!!!!!!! Дешевое ТО, обслуга!!!!!!!!!!! И без пантов!!!!!!!!!!! Русский должен ездить на русской машине!!!!!!!!!!!!!
подробнее
Двигатель ВАЗ 21114 инжекторный 8-клапанный 1,6л.
Описание
Практичный двигатель 21114
Интернет-магазин «ДЕТАЛЬ-ПАРТНЁР» предлагает в нескольких вариациях выгодно купить мощный двигатель 21114, произведенный отечественными инженерами, отличительной особенностью которого является долговечность, надежность, легкость и удобство технического обслуживания. Концерн АвтоВАЗ приступил к разработке мотора 21114 как к модернизации ранней модели из линейки 2111. Суть в том, что базовый узел не удовлетворил действующего на тот момент экологического стандарта «Евро-3», но правда и то, что новая модель полностью устраивала своих создателей, как с технической точки зрения, так и по критериям окупаемости. Был проведен своеобразный тюнинг оборудования, благодаря которому теперь можно купить новый двигатель ВАЗ 21114, имеющий улучшенные характеристики. Различные комплектации данного агрегата полностью соответствуют нормативным требованиям стандартов «Евро-2»-«Евро-4».
Технические характеристики и особенности конструкции
Инженеры смогли сразу предусмотреть возможность проведения тюнинга и создали ДВС 21114 в нескольких конфигурациях. Несмотря на это, общее количество использованных конструкционных приемов ограничено, нужно принимать это к сведению. К примеру, предлагается усовершенствовать только камеру сгорания, а также облегчить КШМ. Однако и этих возможностей достаточно для того, чтобы улучшить характеристики узла. Объем мотора составляет 1,6 литра, мощность установлена в пределах 81,6 лошадиная сила. Рассматриваемый 8 клапанный инжектор обладает небольшим весом, который составляет всего 112 килограмм.
- Достигнуты эксплуатационные показатели за счет внесения изменений в конструкцию. Таким образом, высота цилиндрового блока теперь увеличен на 2,3 миллиметра, изменения коснулись также нового резьбового соединения, который теперь в соответствии со стандартом установлен как М12.
- Маховик и шкив узла используется от ранней модификации ВАЗ-2110. Коленчатый вал был взят от модификации 11183.
- Новый агрегат имеет несколько увеличенное пространство камеры сгорания, теперь это 5х8,1 сантиметр.
Особенности исполнения
Несмотря на базовый показатель мощности, разработчики вложили потенциал на увеличение вплоть до 120 лошадиных сил. Эксплуатационные характеристики в результате такого улучшения не ухудшаются. В том случае, когда тюнинг проводится для спортивных транспортных средств, можно форсировать показатель вплоть до 180 лошадиных сил. Правда потребуется проводить капитальный ремонт чаще, а это уже потребует дополнительных материальных затрат на обеспечение работоспособности авто. Устанавливается мотор на автомобили «Калина», с обслуживание и эксплуатацией не возникнет никаких проблем. Размещенное в конструкции навесное оборудование может быть приведено в движения ремнем. Отличительной особенностью является возможность частичного объединения выхлопной системы и выпускного коллектора. Отдельного внимания заслуживает цена новой модификации, покупатель сможет приобрести мотор на выгодных для себя условиях. Обратите внимание на доступность от сотрудничества с компанией, подберите для своего авто надежный агрегат. Ждём Вашего заказа!
LADA Прокладка коллектора ВАЗ-21114 8кл LADA (ВАТИ), 1314616, 21114-1008080-00
Гарантия на оригинальные автозапчасти
Оригинальные автозапчасти — это товары, выпущенные производителем транспортного средства, либо под его контролем с маркировкой на них товарного знака (логотипа) данного автопроизводителя. Группа БАЛТКАМ предоставляет гарантию качества на оригинальные автозапчасти сроком 45 календарных дней. Если иной срок устанавливается заводом-изготовителем, то устанавливается гарантийный срок завода-изготовителя.
Гарантия на неоригинальные автозапчасти
Неоригинальные автозапчасти / аналоги — это товары, независимых компаний-производителей, специализирующихся на выпуске деталей определенной группы для различных марок и моделей автомобилей. На неоригинальные запчасти Группа БАЛТКАМ предоставляет гарантию сроком 30 календарных дней. Если иной срок устанавливается заводом-изготовителем, то устанавливается гарантийный срок завода-изготовителя.
Условия возврата для розничных клиентов
Условия обмена или возврата товаров, приобретенных в Фирменной Сети Магазинов БАЛТКАМ, регламентируются Законом РФ «О защите прав потребителей» и зависят от качества возвращаемого товара, а также от того, каким образом был приобретен товар (в розничном магазине или в internet-магазине).
Возврат возможен при сохранности товарного вида и без следов установки в течение 14 календарных дней.
Возврат товара, приобретенного в internet-магазине
Вы вправе отказаться от товара в любое время до его передачи, а после передачи товара — в течение семи дней.
При возврате товара надлежащего качества, наличие следов эксплуатации, нарушение товарного вида или целостности упаковки/комплектации может служить основанием для отказа в удовлетворении требований о возврате/замене товара.
Заявления на возврат (для физ.лиц, для юр.лиц) принимаются:
- По электронной почте [email protected]
- Через Почту России заказным письмом.
Срок рассмотрения заявки на возврат составляет 3 рабочих дня, решение высылается на Ваш электронный адрес.
При положительном рассмотрении заявки о возврате необходимо:
- заполнить и распечатать форму заявления
- сдать заявление вместе с деталью в розничный магазин БАЛТКАМ (в котором был приобретен товар) или, в случае удаленной доставки, отправить транспортной компанией.
Возврат денежных средств осуществляется в течение 10 дней со дня предъявления Заявления о возврате товара, а также документов, подтверждающих факт и условия покупки указанного товара.
Для возврата деталей, приобретенных в розничном магазине, обращайтесь в магазин, в котором была приобретена деталь или в центральный офис по адресу: Санкт-Петербург, пр. Полюстровский, 54.
Подбор аккумулятора
1Автомобильные
2Мотоциклетные
3Грузовые
4Тяговые
5Лодочные
6Для детских авто
7Для охранных систем
8Для систем бесперебойного питания (UPS)
9Аккумуляторы START-STOP для автомобилей нового поколения
10Аккумуляторные батареи EFB — аккумуляторы START-STOP
11Аккумуляторы AGM — самые современные и мощные аккумуляторные батареи
12Гелевые аккумуляторы — батареи с желеобразным электролитом
13Аккумуляторы для лодочных электромоторов
14Аккумуляторы для инвалидных колясок
15Аккумуляторы для электропогрузчиков
16Аккумуляторы для подъёмников и штабеллеров
17Аккумуляторы для газонокосилок
18Аккумуляторы для электро и гольф каров
19Аккумуляторы для аварийного освещения в нештатных ситуациях
20Аккумуляторные батареи для систем связи
21Аккумуляторы для кассовых аппаратов
Терапия корневых каналов
Ежегодно в США выполняется более 14 миллионов корневых каналов. Однако, несмотря на то, что это обычная стоматологическая процедура, она по-прежнему вызывает у пациентов мысли о боли и беспокойстве. К счастью, достижения в области технологий и улучшенные анестетики сделали процедуры лечения корневых каналов относительно безболезненными. На самом деле, многие пациенты, которым проводят лечение корневых каналов, сообщают, что во время процедуры не испытывают практически никакой боли.
Корневой канал описывает естественную полость в сердцевине зуба, которая содержит пульповую камеру, мягкую область нервов, инфицирование которой может привести к неблагоприятным состояниям, таким как отек лица и шеи, а также потеря костной массы возле корней зуба.
В Crofton Dental Suite наши сотрудники понимают, что пациенты опасаются по поводу корневых каналов, и будут работать, чтобы облегчить их боль и беспокойство, заставляя их чувствовать себя более комфортно и уверенно.
Когда вам нужен корневой канал?
Вы испытываете сильную боль или дискомфорт во время еды? Ваши зубы чувствительны к высоким и низким температурам? У вас опухшие десны или изменение цвета зубов? У вас есть сколотый или потрескавшийся зуб? Вызывает беспокойство повторяющийся прыщик на деснах?
Если у вас есть один или несколько из этих симптомов, вам может потребоваться корневой канал.Хотя никому не нужен корневой канал, знание того, на какие симптомы следует обращать внимание, может помочь ускорить лечение и устранить дальнейшие проблемы.
В идеале вам следует посещать стоматолога каждые шесть месяцев для планового осмотра. В это время ваш стоматолог Crofton Dental Suite сможет сказать, нужен ли вам корневой канал или вам будет полезен другой вариант лечения.
Процедура корневого канала (шаг за шагом)
Корневые каналы выполняет эндодонтист, стоматолог-специалист, окончивший четырехлетнюю стоматологическую школу, а также два или более лет специализированной подготовки.Для лечения корневых каналов наши стоматологи будут использовать анестетики, чтобы помочь пациентам избежать дискомфорта во время процедуры.
Раньше лечение корневых каналов требовало многократных длительных посещений. Благодаря достижениям в области технологий и техники, большинство пациентов могут завершить процедуру за одно посещение. Однако, если требуется лечение более чем одного зуба или если имеется серьезная инфекция, могут потребоваться дополнительные посещения.
Вот пошаговое руководство о том, чего ожидать во время лечения корневого канала.
- Дантист осмотрит данный зуб и при необходимости введет местный анестетик. После достижения полного онемения стоматолог накладывает небольшую защитную пленку (зубную прокладку) на исследуемую область, чтобы она оставалась изолированной и сухой.
- Стоматолог делает отверстие в коронке зуба и очищает инфицированную камеру пульпы и корневой канал перед формированием пространства для пломбирования.
- Корневые каналы заполняются биосовместимым материалом, на который затем накладывается адгезивный цемент, чтобы корневые каналы оставались полностью герметичными.Это предотвращает дальнейший риск заражения. В большинстве случаев для заполнения любых зазоров используется временная пломба.
- Наконец, на зуб надевается коронка или другая реставрационная капсула, чтобы вернуть ему полноценное функционирование.
Обработка большинства корневых каналов занимает около 90 минут, после чего требуется некоторое время на восстановление. Однако помните, что продолжительность процедуры и количество посещений могут варьироваться в зависимости от различных факторов.
Поскольку в корневом канале используется местный анестетик, вам не будет мешать поездка домой, потому что его эффекты проходят в течение нескольких минут после прекращения приема.
Чего ожидать после корневого канала
После корневого канала у вашего зуба будет гораздо больше шансов остаться нетронутым. Дантист может наложить коронку на пораженный зуб, чтобы скрыть случайные дефекты или изменение цвета.
Если вы почувствуете боль, не пугайтесь. Часто пациенты испытывают легкий дискомфорт после прохождения корневого канала в течение одного или нескольких дней. Это нормальная реакция, которую можно эффективно лечить безрецептурными обезболивающими.При необходимости врач также может назначить более сильное лекарство. Чтобы предотвратить дальнейшее разрушение, продолжайте соблюдать правила гигиены полости рта, например чистить зубы щеткой и зубной нитью.
Питание после корневого канала
Решение, что есть после процедуры на корневом канале, может быть сложной задачей, потому что все по-разному реагируют на процедуру. Индивидуальные болевые пороги измерить непросто. В результате определение того, что можно и что нельзя есть после корневого канала, может быть проблематичным.
Пациентам рекомендуется есть мягкую пищу в течение двух-трех дней после лечения корневых каналов.Их также просят избегать слишком горячей или холодной пищи. Кроме того, после еды лучше медленно жевать ту сторону рта, которая находится напротив того места, где вас лечили.
К счастью, только то, что вам нужно есть осторожно после корневого канала, не означает, что вы не можете есть продукты, которые вам нравятся. Вот примерный список рекомендуемых продуктов, которые можно есть после корневого канала.
- Смузи
- Йогурт
- Пудинг
- Молочные коктейли
- Яйца
- Суп
- Тофу
- Злаки
- Бананы
- Персики
- Груши
- Яблочное пюре
- Суши
- Макаронные изделия
- Блины
Пациентам, выздоравливающим по поводу корневого канала, также не рекомендуется употреблять алкоголь, есть что-нибудь острое, хрустящее или чрезмерно жевательное, например жевательную резинку или ирис.
Стоит ли мне посещать стоматолога после процедуры корневого канала?
Обязательно запишитесь на прием к стоматологу после прохождения корневого канала. Процедуры лечения корневых каналов сложны, и на последующее заживление зуба может потребоваться значительное время. В период заживления ваш зуб чувствителен и уязвим, а также подвержен большему риску перелома, поэтому запланируйте повторный прием, чтобы убедиться, что ваш зуб заживает должным образом и не возникнет постоперационных осложнений.
Если вы испытываете боль или дискомфорт или хотите узнать больше о лечении корневых каналов, запишитесь на обследование сегодня, позвоните нам в Crofton Dental Suite по телефону 410-721-2610 сегодня!
Поликлональные антитела против Chk1 (Ab-317), SAB-21114 Поликлональные антитела против Chk1 (Ab-317)
, SAB-21114 | ARP American Research Products, Inc.
Магазин не будет работать корректно, если куки отключены.
Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript.
Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.
Название продукта | Поликлональные антитела против Chk1 (Ab-317) |
---|---|
Хост | Кролик |
Реакционная способность | Человек |
Приложения | IHC, WB |
Хранилище | Хранить при -20 ° C |
Использование по назначению | Только для исследовательских целей |
Все продукты для исследований продаются ТОЛЬКО для лабораторных исследований и НЕ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ДЛЯ ЛЕЧЕБНЫХ ИЛИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРИЛОЖЕНИЙ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЖИВОТНЫХ.Представленная информация считается точной; однако указанная информация и продукты предлагаются без гарантии или гарантии, поскольку конечные условия использования и вариативность обрабатываемых материалов находятся вне нашего контроля. Ничто из раскрытого здесь не может быть истолковано как рекомендация использовать наши продукты в нарушение каких-либо патентов. ARP American Research Products, Inc. не представляет свои продукты на рассмотрение регулирующим органом каким-либо государственным органом или другой организацией, и мы не проверяем их для клинического, терапевтического или диагностического использования, а также на предмет безопасности и эффективности.Вы несете единоличную ответственность за то, чтобы способ использования продуктов соответствовал применимым законам, постановлениям и правительственным политикам, а также за получение всех необходимых разрешений, прав интеллектуальной собственности, лицензий и разрешений, которые могут вам понадобиться в связи с вашим использованием. Ни при каких обстоятельствах ARP American Research Products, Inc. не несет ответственности за ущерб, косвенный, компенсационный, случайный или специальный, строгую ответственность или небрежность, нарушение гарантии или любую другую теорию, возникшую в результате использования продуктов, доступных от ARP American Research. Продукты, Inc.Ничто из содержащегося здесь не гарантирует, что использование продуктов не будет нарушать притязаний каких-либо патентов, касающихся самого продукта или его использования в сочетании с другими продуктами или в работе любого процесса. ARP American Research Products, Inc. отказывается от любых заявлений или гарантий любого рода, явных или подразумеваемых, включая, помимо прочего, любые подразумеваемые гарантии товарной пригодности или пригодности для конкретной цели, ненарушения прав или результатов, полученных в результате использования любого продукта, независимо от того, вытекает ли он из закона или иного закона, или в результате выполнения, деловых операций или использования торговли.
Есть вопросы?
Представитель службы поддержки ARP будет рад помочь!
Вырастет ли у моего ребенка голубиные пальцы ног?
опубликовано: 07 января 2019.
Когда ваш ребенок начинает вставать и пытаться делать самые первые шаги, это кажется таким большим достижением. Ваш ребенок так быстро растет и так много учится, что за ним трудно уследить. Тело также развивается быстрыми темпами, и теперь вам нужно учитывать гораздо больше, когда речь идет о физическом росте!
Прежде чем вы это узнаете, ваш малыш станет опытным ходунком и вскоре направится в дошкольное учреждение.Ох, как летит время. Но подождите, он немного странно ходит? Может, он не перерос врата новичка? Может показаться, что он даже спотыкается о собственные ноги. Вам стоит волноваться?
Пока не волнуйтесь. Возможно, ваш ребенок просто увлекается, когда учится ходить. Более известное как «косолапость», оно описывает состояние, при котором пальцы его ног указывают внутрь, навстречу друг другу, а не прямо вперед.
Возможные причины голубиных пальцев на ногах:
- Врожденный: когда он был в утробе матери, у него могло не хватить места для роста ступней.Это могло привести к тому, что его ноги загнуты внутрь.
- Генетика: Пальцы голубей могут быть унаследованы от родителей.
- Искривление костей ног: В детстве его кости могли немного вырасти, из-за чего ступни повернулись внутрь.
- Повернутые тазобедренные кости: если тазобедренные кости развиваются ненормально, это также может вызвать поворот остальной части ноги.
Хорошая новость в том, что со временем состояние обычно проходит само. Наш ортопед может помочь тем, у кого, кажется, есть более чем легкая форма заболевания пальцев стопы голубя.
Варианты лечения будут включать:
- Шинирование или гипсовая повязка, если состояние тяжелое с рождения.
- Растяжка и массаж, помогающие ноге со временем решить проблему.
- Ортопедические вставки или туфли, которые помогают стопе указывать вперед.
- Операция, но только если проблема серьезная и мешает образу жизни, и не проходит к 10 годам.
Помните, что когда дело касается детских ножек, боли роста не являются частью взросления.Наш ортопед поможет вам пройти через процессы развития, чтобы облегчить ваше сознание. Запишитесь на прием к нашему сертифицированному ортопеду доктору Брэду Толлу, который поможет вам найти лечение для ног ваших детей. Позвоните в Crofton Podiatry сегодня по телефону (410) 721-4505. Мы предоставляем услуги в районах Крофтон, Гэмбриллс, Одентон и Боуи, штат Мэриленд.
# 1 21114 Уничтожитель клопов и борьба с вредителями! Лечение и удаление
Ваш лучший способ избавиться от клопов в 21114
Яйца постельных клопов, взрослые постельные клопы, укусы постельных клопов, черные пятна показывают, что они рядом, с доказательствами наличия постельных клопов в пружинных коробках.Есть несколько способов, с помощью которых постельные клопы будут замечены, но к тому времени у вас уже будет серьезная ситуация с живыми ошибками, которую необходимо решить.
Обнадеживающая новость заключается в том, что наряду с другими заражениями вредителями, которые мы устраняем в 21114, мы являемся специалистами в обнаружении всех стадий клопов и использовании процедур, которые, независимо от размера или характеристик ситуации, эффективно устранят клопов.
Мы — специалисты по поиску постельных клопов, готовые устранить серьезную проблему
Нам известно, что 21114 постельных клопов достигли такого уровня, что их сейчас чрезвычайно сложно остановить.По правде говоря, мы знаем, что округ Колумбия считается одним из самых проблемных городов для клопов. По этой причине, независимо от того, идет ли речь о экологически чистой обработке, термической реабилитации, обработке паром, обычном методе, крионите или любом другом предлагаемом подходе, наши специалисты по уничтожению насекомых приложат все усилия, чтобы обеспечить 100% эффективный контроль над ошибками.
➔ Если вы являетесь домовладельцем в 21114 и нуждаетесь в термической обработке клопов, которая буквально полностью убивает клопов, не стесняйтесь обращаться к нам.Мы немедленно решим проблему и исправим ее навсегда!
Позвоните нам по телефону (202) 750-4066
Получите бесплатное предложение и прочтите отзывы наших клиентов
Наша библиотека вредителей открыта для всех
Мы осознаем, что просвещенные домовладельцы будут принимать более правильные решения, увидим ценность, которую мы предлагаем как средства уничтожения клопов 21114, и понимаем проблемы, которые требует идеальное решение для постельных клопов.Именно поэтому мы предлагаем бесплатную библиотеку вредителей, которая помогает клиентам узнать, с какими формами опасений по заражению насекомыми они могут столкнуться.
Позвоните нам по телефону (202) 750-4066
Получите бесплатное предложение и просмотрите наши рейтинги клиентов
Борьба с вредителями 21114 приобрела новое значение, потому что мы предоставляем качественные услуги. Вот решения для борьбы с вредителями , которые мы предлагаем:
Ant Management — Многие компании, занимающиеся борьбой с вредителями, могут испытывать трудности с управлением муравьями, потому что они легко станут неконтролируемыми.К счастью, мы понимаем, как с ними бороться и полностью исключить нашествие муравьев, независимо от того, насколько оно массово.
Постельные клопы — Атаки постельных клопов превращаются в боль в 21114 году и по всем США. Некоторые люди пытаются убить клопов неправильным лечением, только усугубляя проблему. Вот почему вам понравятся наши высококвалифицированные и компетентные службы борьбы с постельными клопами — ведь они никогда не подводят!
Жуки — Каждый раз, когда вы хотите искоренить жуков, вы отдадите предпочтение любому из наших экспертов в вашем доме как специалисту по борьбе с вредителями, который знает, как заставить их исчезнуть.
Box Elder Bugs — Хотите, чтобы они были устранены? Поговорите с нами по тарифу с нулевыми затратами, и позвольте нам сделать все, что в наших силах, чтобы проблемы заражения вредителями были хорошо решены и ваш комфорт восстановлен.
Carpenter Ants — Каждый раз, когда муравьи-плотники оказывались серьезной проблемой в 21114 жилых домах и организациях, нас призывали предоставить наши средства борьбы с вредителями для жилых и коммерческих помещений.
Пчелы-плотники — Мы были ведущими специалистами в области пчеловодства в 21114 году по одной причине: они будут уничтожены, как только мы с ними покончим.
Тараканы — В Хайтс, Мэриленд и во многих других 21114 районах, тараканы создают проблемы для домашних хозяйств. Наш процесс обработки этих вредителей разработан таким образом, чтобы успешно уничтожить их, несмотря на их крайнюю настойчивость, поэтому многие компании по борьбе с вредителями не могут их уничтожить.Для нас неудача, конечно же, не альтернатива.
Уховертки — Избавиться от них может быть сложно, если вы не знаете, как их делать. Для нас это просто потому, что мы на собственном опыте узнали, как предотвратить их на вашем месте.
Блохи — Один из самых привычных вредителей, вызывающих беспокойство. Не расстраивайтесь из-за проблем с блохами — просто свяжитесь с нами, чтобы получить бесплатную скидку, чтобы избавиться от них раз и навсегда.
Божьи коровки — В то время как некоторые люди найдут их в некотором роде невинными, на самом деле никто не посетит вас, когда они будут иметь дело с проникновением божьих коровок. Наша стратегия целенаправленна и ориентирована на ваше благополучие, поэтому мы рассматриваем присутствие божьей коровки как проблему, которую наши службы борьбы с вредителями должны устранить.
Rodent Control — Внешний вид вашего дома — не единственное место, где обычно появляются мыши, крысы и грызуны.Они также могут находиться внутри, и по прошествии времени начинают наносить достаточно ущерба, чтобы сделать ремонт дома важным — но не волнуйтесь — где бы они ни находились, истребители 21114 звонят каждый раз, когда требуется борьба с грызунами. Мы придем и устраним их за вас.
Комары — Они шумные, кусаются и вредны для здоровья. Никто не хочет, чтобы они были рядом с ними, и наша команда специалистов по борьбе с вредителями, обслуживающая 21114, позаботится о том, чтобы они были уничтожены очень быстро.
Периодические захватчики — Сверчки, пилюлики, многоножки, серебрянные рыбки и кластерные мухи
Зимующие вредители — В 21114 мы помогаем устранять постоянное беспокойство каждый раз, когда погода холодная и влажная.Все время.
Вредители кладовой — Зубчатые зерновые жуки, индийская мучная моль и сигаретный жук
Пауки — Все они доставляют неудобства, которые перестанут быть проблемой, когда вы свяжетесь с нами, чтобы помочь вам избавиться от них.
Жалящие насекомые — Желтые куртки, бумажные осы, лысые шершни и медоносные пчелы. Эти насекомые кусаются, и вы не хотите рисковать с ними.Свяжитесь с нами, и мы будем их контролировать!
Stink Bugs — Мы являемся наиболее предпочтительным средством устранения ошибок в 21114, чтобы помочь вам исправить проблемы с вонючими ошибками. По факту.
Свяжитесь с нами по телефону (202) 750-4066
Получите бесплатное предложение и проверьте наши обзоры
Пять причин, по которым вы предпочтете нас в качестве истребителя клопов и надежного истребителя вредителей рядом с вами
- Наше лечение от клопов в 21114 — это полезный и удобный сервис.Мы приезжаем вовремя, мы тщательно, несем ответственность за ваше благополучие и сосредоточены на полном устранении клопов и любых других распространенных проблем с вредителями, которые могут у вас возникнуть.
- Мы применяем только безопасные, надежные, успешные и экологически безопасные средства борьбы с вредителями. Конечно, ваша безопасность, а также здоровье вашей семьи, дома и бизнеса — вот основание того, почему мы работаем, чтобы быть самыми надежными и эффективными специалистами по постельным клопам в 21114 и окрестностях.
- Помимо того, что все наши технические специалисты являются экспертами по избавлению от клопов в машине 21114, они также являются чрезвычайно компетентными и опытными профессионалами, прошедшими проверку на наличие судимостей.
- Мы работаем с учетом вашего маршрута и стремимся предоставить эффективные средства борьбы с вредителями и методы лечения, которые просто избавят вас от вашей суетной рутины.
- Эффективность интегрированных решений по борьбе с вредителями, которые мы предлагаем для вашего дома или бизнеса 21114, удобство, которое входит в наши услуги, и поскольку мы считаем услугу завершенной только тогда, когда нет вредителей, которые вас беспокоят, оставляет наших высококачественных вредителей доступные решения по борьбе с вредителями, потому что они будут постоянно бороться со всеми вредителями, с которыми вы можете столкнуться.
Служба контроля термитов, которая дает результаты
Термиты огромны, и с ними сложно обращаться. Они съедят потолки и полы и быстро станут неконтролируемыми. К счастью, вам не нужно беспокоиться о разрушениях из-за их присутствия. Наша служба по борьбе с термитами никогда не останавливается, чтобы полностью уничтожить нашествие термитов.
Подлинная оценка
Наш послужной список очевиден: мы абсолютно прозрачны и, если мы не обнаружим каких-либо проблем с вредителями или других проблем во время проверки клопов, мы немедленно сообщим вам об этом.Проще говоря, мы не заставим вас тратить ваши кровно заработанные ресурсы. Тем не менее, если мы все же столкнемся с проблемой, требующей борьбы с постельными клопами или борьбы с вредителями, мы немедленно сообщим вам и предложим индивидуальный план лечения, который будет доступным и действенным в дождь или солнце.
Лицензионный, таможенный Истребитель в 21114
Мы входим в число немногих лицензированных и застрахованных компаний по борьбе с вредителями, обслуживающих 21114. Мы очень довольны качеством предоставляемых нами надежных услуг по борьбе с постельными клопами, и мы понимаем, насколько важно, чтобы семьи чувствовали себя в безопасности в отношении компании-истребителя, которую они нанимают.
Именно поэтому мы посоветуем вам поискать в Google «истребители рядом со мной в 21114», и вы увидите, как комментарии и оценки наших клиентов позволят вам выбрать наши услуги.
Мы используем только экологически безопасные решения
Это одно из качеств, которые оценивают нас как лучший истребитель клопов 21114, который когда-либо мог иметь. В сочетании с использованием самых сложных и эффективных протоколов лечения постельных клопов, а также протоколов удаления домашних и коммерческих животных на рынке.Мы в равной степени стремимся обеспечить безопасность вашего дома или бизнеса и сохранить здоровье на планете.
Готовы начать работу?
Готовы восстановить свой комфорт и избавиться от всех вредителей, которые могут вас беспокоить? Свяжитесь с нами немедленно, чтобы получить оценку с нулевой стоимостью и воспользоваться предложениями лучшей службы борьбы с вредителями 21114! Ознакомьтесь с нашими часто задаваемыми вопросами!
Свяжитесь с нами по телефону (202) 750-4066
Получите бесплатное предложение и проверьте наши обзоры
посещений больных детей | Педиатрия Аннаполиса
Обычно родители не знают заранее, когда их дети заболеют.Почему-то кажется, что это всегда происходит в наименее удобное время: среди ночи, непосредственно перед ужином, вечером в пятницу и в праздничные выходные. Мы знаем это, потому что мы тоже родители.
Annapolis Pediatrics обеспечивает превосходную медицинскую помощь здоровым и больным детям, и мы знаем, что наши пациенты любят посещать здоровых детей, чтобы иметь возможность поговорить со своим педиатрическим врачом и оставаться в курсе здоровья своих детей и долгосрочного ухода, но наши больные визиты — это то место, где мы действительно помогаем пациентам и их семьям.Основную информацию о некоторых медицинских состояниях, с которыми вы можете столкнуться, можно найти на нашей странице «Ресурсы для родителей».
* Вам нужно явиться к больному? Забронируйте здесь!
Назначьте встречу с больным в тот же день — теперь можно записаться прямо онлайн в наш офис на 3-м этаже в Аннаполисе!
- Визиты по болезни теперь будут видны врачу в офисе без необходимости предварительного виртуального посещения. Тестирование на COVID будет проводиться только для тех пациентов, у которых есть симптомы или которым необходимо вернуться в школу, детский сад и т. Д.
- Виртуальные посещения будут по-прежнему доступны для некоторых посещений больного, консультаций и посещений по вопросам психического здоровья.
- Мы по-прежнему будем проходить регистрацию из машины, и маски по-прежнему необходимы на протяжении всего визита для всех, кто входит в наши офисы.
- Наши часы приема по-прежнему закрыты; все посещения должны быть запланированы заранее.
Посетите нашу страницу виртуальных посещений, чтобы узнать больше и узнать, как подготовиться к виртуальному посещению.
Посещения больного можно обрабатывать разными способами, в зависимости от того, что вам больше всего нужно:
Плановые посещения по болезни
Чаще всего, когда ваш ребенок болеет, вы звоните на нашу линию записи или бронируете онлайн-визит в тот же день в наш офис на 3-м этаже в Аннаполисе.Большинство посещений больного назначаются в один и тот же день. Мы выделяем значительное количество времени каждому поставщику в офисе каждый день для посещения больничного в тот же день.
Если вы знаете, что хотите привести ребенка на прием по болезни, мы рекомендуем вам позвонить как можно раньше, начиная с 8 часов утра. Посещения по болезни можно быстро записывать, особенно в определенное время года. Мы также выделяем дополнительных врачей и практикующих медсестер, чтобы удовлетворить дополнительную потребность в посещениях больниц в напряженное время года.
Обязательно сообщите как можно больше информации о болезни вашего ребенка, когда звоните, чтобы записаться на прием. На решение некоторых проблем со здоровьем требуется больше времени, чем для решения других, и мы хотим быть уверены в том, что ваш ребенок будет правильно запланирован.
Посещение больных: кого вы увидите?
Вы можете назначить больничный визит к любому поставщику услуг и в любом офисе. Мы знаем, что обычно родителям удобнее всего общаться со своим постоянным врачом или практикующей медсестрой, поэтому обязательно спросите, работает ли ваш поставщик в этот день и в каком офисе.Однако не волнуйтесь, если ваш постоянный поставщик услуг недоступен. Благодаря нашей новой системе электронных медицинских записей информация о вашем ребенке доступна любому поставщику медицинских услуг в любом из наших офисов.
Врачи и медсестры педиатрической клиники Аннаполис гордятся своими индивидуальными медицинскими способностями, но все они стремятся обеспечить постоянный уход, который соответствует очень высоким стандартам практики. Встречаясь с другими поставщиками медицинских услуг во время посещений больного, вы, скорее всего, обнаружите, что у каждого из наших врачей и практикующих медсестер есть свой уникальный стиль, но что вся группа работает вместе как одна команда; так, как это должно быть.
Лучшие 10 вариантов аренды для отпуска Airbnb в Крофтоне, Мэриленд —
Этот кондоминиум, недавно прошедший ремонт, находится недалеко от торгового района города, местных ресторанов, супермаркетов, кинотеатра, кафе Starbucks и Target. Он довольно современный, оформлен в продуманном стиле Costal Casual. До него также можно легко добраться из Балтимора и Аннаполиса. Он находится всего в 20 минутах езды от метро DC, железной дороги MARC и Военно-морской академии. Гости имеют доступ ко всем уголкам дома и имеют привилегию воспользоваться высокоскоростным Интернетом, зарезервированным местом для парковки, а также потоковыми сервисами, такими как Hulu и Netflix.
Кондо с новым ремонтом рядом со всем
Crofton, Мэриленд, США
42
отзывы
Таунхаус целиком
3 кровати
2 спальни
1 ваннаяЛучшие отзывы гостей
Удобства и номер:
домашний компьютер с апплетом принтера с приложениями и фильмами отличная кухня и огромная хозяйская комната
у нас были замечательные 4 ночи в этом комфортабельном кондоминиуме
Чистота:
чистые и тщательно обставленные
Дом Криса был чистым и красиво оформленным
просторные апартаменты были очень чистыми и хорошо укомплектованы всем необходимым для путешественников
его место было чистым, хорошо обставленным, и регистрация прошла без трения современный чистый
Хост:
хозяин очень отзывчивый на все вопросы
спасибо внимательным хозяевам
крис был очень отзывчивым хозяином
он очень отзывчивый и внимательный
крис очень вежливый и дружелюбный, быстро отвечает
Расположение:
прекрасное расположение
очень уютный и тихий район, рядом с различными торговыми центрами
отличное пребывание в прекрасном месте и дома
chris’s place — отличная комфортабельная квартира в супер удобном месте
отличное место, которое рядом со всем, что вы мог бы хотеть
Прочитать больше отзывов
Этот прекрасный дом расположен в зарезервированном районе, всего менее чем в 2 милях (3.2 км) от прекрасных ресторанов, торгового района, кафе Starbucks, IHOP, Dunkin Donuts и многого другого. Здесь есть большинство вещей, которые вам понадобятся для беззаботного проживания, такие как бесплатная парковка, Wi-Fi и предметы первой необходимости, такие как шампунь, полотенца, простыни, мыло и туалетная бумага. Единственным недостатком является то, что гости не смогут готовить еду на кухне, но кому она нужна, когда завтрак будет подан по утрам? Поговорим об инклюзивности!
Прекрасный люкс с красивым видом на сад
Crofton, Мэриленд, США
117
отзывы
Отдельная комната в таунхаусе
3 кровати
1 спальня
1 ваннаяЛучшие отзывы гостей
Удобства и номер:
Пространство тамми безупречно и очень удобно
мы оценили список закусок и напитков и информацию с паролем Wi-Fi и другими полезными инструкциями
несмотря на то, что это было подвальное помещение, в нем было внешнее освещение и оно было комфортным и гостеприимным оставайся, пока я был в городе на работе
кровать супер удобная
Чистота:
чистое и уютное
очень чистое удобное место для проживания
чистая комната и собственная ванная комната
очень чистая и удобная
чистая ванная комната прямо за спальней
Хост:
тамми, хозяин очень добрый
тамми был замечательным хозяином
тамми отличный хозяин
она дала мне несколько полезных мест, где можно поесть и пообщаться
тамми замечательный и любезный хозяин
Расположение:
идеальное расположение недалеко от аннаполиса
мы были в гостях у друга очень близко и оценили близость к ним
расположение в отличном районе и парковка на улице была удобной и безопасной
район потрясающий, есть еда и развлечения рядом by
Район безопасный и тихий
Прочитать больше отзывов
Вот отличный выбор для двух гостей на ночь или даже если они намерены задержаться немного дольше.Этот красивый номер в квартире располагает удобной кроватью размера «queen-size», хорошо оборудованной кухней, ванной комнатой и гостиной. На самом деле в квартире сдается две спальни, поэтому, если гости хотят уединения, лучше забронировать обе комнаты. Отель находится примерно в 20 минутах езды от аэропорта BWI-Thurgood Marshall, Аннаполиса и Балтимора. Гости могут привезти автомобиль, который они могут бесплатно припарковать на территории отеля.
Кирпичный дом: 2-х комнатная квартира недалеко от BWI, Аннаполис
Millersville, Мэриленд, США
121
отзывы
Квартира целиком
2 кровати
2 спальни
1 ваннаяЛучшие отзывы гостей
Удобства и номер:
В моей комнате был письменный стол, удобно расположенный в комнате с открытым пространством, где можно было перемещаться
В этом месте есть полезные и красивые удобства, включая хорошо оборудованную кухню
Интересный факт: в комнате 1 есть электрический камин neato
Чистота:
чисто тихо и удобно
всегда удобно чисто и тихо
было чисто и уютно
очень чистое и стильное место
супер чисто и очень уютно
Хост:
она замечательный хозяин
отличный хозяин очень рекомендую
elaine был замечательным хозяином
хозяева добрые и гостеприимные
elaine был прекрасным хозяином
Расположение:
расположение дома идеальное
тихое место и отличное место для проживания в доме продуманные интерьеры и украшения
прекрасное место, куда можно вернуться после целого дня
мы не могли и мечтать о лучшем месте остановиться
Я определенно рекомендую его всем, кто ищет место в районе
Прочитать больше отзывов
Для небольших семей, посещающих Крофтон, этот отдельный номер идеально подходит, поскольку он просторный и домашний.Помимо просторной спальни, в дополнительном пространстве есть собственная ванная комната с душем. Чтобы развлечь семью, есть бесплатный Wi-Fi, телевизор с плоским экраном и Netflix (Roku), Sling TV, стол для пинг-понга, художественные принадлежности и настольные игры. Если этого будет недостаточно, гости могут прогуляться по окрестностям, где они могут найти магазины и местные рестораны, чтобы попробовать!
Большой люкс рядом с Аннапом, округ Колумбия и Балт. с собственной ванной
Crofton, Мэриленд, США
70
отзывы
Отдельная комната в доме
2 кровати
1 спальня
1 ваннаяЛучшие отзывы гостей
Удобства и номер:
есть холодильник для гостей и хорошее подключение к Интернету (wi-fi)
в доме есть красивый внутренний дворик и кухня, которую нам разрешила Эрин
в гостиной есть хороший плоский экран с кабелем и Wi-Fi. fi был доступен
кровать идеальна
великие люди, которые предложили комфортный сон / жизнь
Чистота:
это чисто и в тихом районе
место исключительно чистое, удобное и уединенное
их место было очень просторным, чистым и удобным
отличное дружелюбное место очень чистое и отличное соседство
имел весь подвал для меня, который был очень чистым и комфортный
Хост:
они были идеальными хозяевами
замечательный хозяин, с которым приятно поболтать и с радостью ответить на любые вопросы
Клаудия была очень отзывчива и гостеприимна
отличный отдых с замечательными хозяевами
отличный хозяин я не был разочарован
Расположение:
это место — отличное место, если у вас есть несколько мест для посещения
мы определенно рекомендуем это место
это было превосходно, так как мы выбрали это место из-за его близости к фестивалю возрождения Мэриленд
это было идеальное место между балтимором и dc
настоятельно рекомендую отличное расположение в центре множества мест назначения
Прочитать больше отзывов
Этот дом расположен в красивой лесистой местности вдоль бухты Бойд на Саут-Ривер. Он идеально подходит для больших семей или групп, которые хотят исследовать Крофтон в целом.Он находится рядом с историческим центром Аннаполиса, внутренней гаванью Балтимора, Вашингтон, округ Колумбия, а также с Военно-морской академией. Пребывание в этом доме дает гостям множество развлечений, включая кабельное телевидение, театр и бильярдный зал, тренажерный зал, каяки и открытый бассейн с джакузи. Пространство дает необходимое уединение и недалеко от центра города.
Дом на набережной с бассейном, ванной, каяками
Аннаполис, Мэриленд, США
77
отзывы
Весь дом
6 спальных мест
5 Спальни
4 ванные комнатыЛучшие отзывы гостей
Удобства и номер:
мы воспользовались большинством удобств, включая тренажерный зал с джакузи и развлекательные системы.
дом был уединенным и имел очень красивый вид на воду из бассейна.
дом огромен, с множеством кроватей и дополнительными спальными местами. мест
комфортно для нашей толпы с большим количеством места для отдыха и расслабления
на заднем дворе есть красивый бассейн и гриль, идеально подходящие для летних выходных с друзьями
Чистота:
очень чистый и просторный
дом был также чистым, и Майк предоставил нам полотенца чистое постельное белье и т. Д.
дом был просторным, очень чистыми удобными кроватями, и нам очень понравился бассейн
очень чистый и просторный дом отличное место для большой семейной встречи
Дом красиво оформлен и безупречен
Хост:
владелец — хорошие люди
Майк и Джо были отличными хозяевами
Майк и Джо — отличными хозяевами
Майк был отличным хозяином для нашей вечеринки из 14 человек
хозяин был лучшим
Расположение:
отличное расположение в 15 минутах от центра города Анаполис
этот дом находится в прекрасном месте
прекрасное место это было идеальное место для наших девичьих выходных
надеюсь, что я смогу вернуться и посетить это место еще раз в ближайшем будущем
это было отличное место для многосемейной группы
Прочитать больше отзывов
Вся эта квартира построена, чтобы стать вашим домом вдали от дома в Мэриленде.Пространство поставляется с отдельным входом, кухней, ванной, стиральной машиной, сушилкой и парковкой во дворе. В гостиной также есть надувной матрас, который идеально подходит, если вы путешествуете всей семьей. Кроме того, это будет ваш шанс побывать рядом с такими мероприятиями, как магазины, рестораны, посещение парков, исторических мест, а также Военно-морской академии США. Собственно говоря, дом уже встретит вас в морской тематике.
Уютный район Аннаполиса, все близко!
61
отзывы
Квартира целиком
2 кровати
В самом сердце Боуи, где парки, рестораны, великолепные виды, а также искусство и культура города, это уютный отдельный номер, идеально подходящий для одного или двоих.Помимо спальни, гости имеют доступ к кухне, просторному рабочему месту, парковке и ванной комнате с ванной. В распоряжении гостей некоторые предметы первой необходимости, такие как шампунь, постельное белье и полотенца, а также кондиционер и отопление. Таким образом, вы можете иметь комфортабельный дом и прекрасное расположение одновременно, путешествуя по окрестностям. Здесь нет Wi-Fi, но достаточно кабельного телевидения, чтобы развлекаться на протяжении всего пребывания!
Простота во всей ее красе
53
отзывы
Приватная комната
1 кровать
Кто бы не хотел иметь частное жилье рядом почти со ВСЕМ в городе? Хотя вы снимаете в доме только отдельную комнату, это не ограничивает доступ гостей к объектам и удобствам дома.В гостевом номере, например, есть собственная гостиная с раскладным диваном-кроватью, на котором могут разместиться до 5 человек. Ранее апартаменты использовались для приема гардемаринов Военно-морской академии США, поскольку они находятся всего в 10-15 минутах езды от Военно-морской академии США и гавани Аннаполиса.
Annapolis Getaway — почти все!
41 год
отзывы
Приватная комната
4 кровати
Вся эта каюта — еще один вариант, если вы собираетесь большой группой до 12 человек, посещающей город.Это художественно оформленный коттедж в загородном стиле, расположенный в лесу прямо у реки. И я ручаюсь, что это частное жилье — лучшее место для книг! На самом деле, держу пари, вы не сможете выйти из дома и только наслаждаться этим местом. На территории отеля вы можете заняться такими видами активного отдыха, как гребля на каноэ, каякинг, просторная открытая веранда, гриль и барбекю на базе копчения, частный причал и многое другое. С террасы открывается вид на залив Литл-Раунд и остров Святой Елены. И вы можете посетить близлежащие места, такие как центр Аннаполиса, Военно-морская академия, магазины, музеи, рестораны, если хотите!
The Red Rooster Inn & Cabin
20
отзывы
Вся каюта
8 спальных мест
Начнем с частной комнаты, расположенной в Боуи, штат Мэриленд, рядом с центром города Боуи.Он находится примерно в 20 минутах езды от центра города Крофтон и обещает обеспечить удобный транспорт, будь то частный или общественный. Помимо чистого и удобного отеля, гости также могут воспользоваться бесплатной парковкой на территории, при условии, что они не припаркованы на подъездной дорожке, что делает ее подходящей для гостей, которые предпочитают приезжать на автомобиле. К сожалению, приготовление еды в помещениях запрещено, но для удобства предоставляются холодильник и микроволновая печь.
Номер с высоким рейтингом в Боуи, недалеко от округа Колумбия
Боуи, Мэриленд, США
95
отзывы
Отдельная комната в доме
1 кровать
1 спальня
1 ванная
Давай в Крофтон!
Ты все еще думаешь о скорейшем посещении этого места? Не думайте больше, потому что Крофтон — тихий город, который на удивление предлагает множество развлечений, а также достопримечательности, которые необходимо посетить, не говоря уже о местных блюдах, которые стоит попробовать.Надеюсь, я смог помочь вам выбрать лучшее место для вашей следующей поездки в город!
Раскрытие информации: Trip101 самостоятельно выбирает списки в наших статьях. Некоторые списки в этой статье содержат партнерские ссылки.
Одномолекулярный взгляд на координацию в многофункциональной ДНК-полимеразе
Abstract
Репликация и репарация геномной ДНК требует действия нескольких ферментативных функций, которые должны быть скоординированы для обеспечения эффективного и точного образования продукта.Здесь мы использовали FRET-микроскопию одиночных молекул для исследования физических основ функциональной координации в ДНК-полимеразе I (Pol I) из E. coli , ключевом ферменте, участвующем в репликации отстающей цепи и эксцизионной репарации оснований. Pol I содержит активные сайты для матричной полимеризации ДНК и процессинга 5’-лоскута в отдельных доменах. Мы показываем, что ДНК-субстрат может спонтанно переноситься между доменами полимеразы ( pol ) и 5 ’нуклеаз ( 5’ nuc ) во время одного контакта с Pol I.Кроме того, мы показываем, что гибко связанный домен 5 ’nuc занимает различные положения в комплексах Pol I-ДНК, в зависимости от природы ДНК-субстрата. Наши результаты показывают структурную динамику, которая лежит в основе функциональной координации в Pol I и, вероятно, имеет отношение к другим многофункциональным ДНК-полимеразам.
Введение
ДНК-полимеразы многих организмов должны координировать множественную ферментативную активность для достижения точной и эффективной репликации и репарации ДНК, избегая при этом образования мутагенных или нестабильных промежуточных продуктов ДНК ( Reha-Krantz, 2010; Bębenek and Ziuzia- Graczyk, 2018 ).ДНК-полимераза I (Pol I), ключевой фермент, участвующий в репликации и репарации ДНК в E. coli ( Makiela-Dzbenska et al., 2009; Imai et al., 2007; Patel et al., 2001 ), содержит три различных ферментативных активности в одном полипептиде из 928 остатков: ДНК-зависимая 5′-3′-полимераза ( pol ), проверяющая 3′-5′-экзонуклеаза ( exo ) и 5′-нуклеаза ( 5 ‘nuc ) ( Kelley and Joyce, 1983; Setlow and Kornberg, 1972, ).Активности pol и exo содержатся в отдельных доменах, которые вместе составляют основную часть фермента, тогда как активность 5 ‘nuc расположена в независимом домене, который связан с телом неструктурированным 16-аминокислотным остатком. кислотный (аа) пептидный линкер. Домен 5 ’nuc относится к семейству структурно-специфичных ДНК-нуклеаз из семейства эндонуклеаз лоскута (FEN) ( Harrington and Lieber, 1994, ).
Pol I играет важную роль в репликации отстающей цепи ДНК в E.coli ( Balakrishnan, Bambara, 2013; Okazaki et al., 1971, ). Во время этого сложного процесса короткие праймеры РНК отжигаются с отстающей цепью и удлиняются ДНК-примазой, образуя слитые цепи РНК-ДНК (фрагменты Окадзаки). Возникающая часть ДНК впоследствии удлиняется Pol I, пока растущая цепь не встретит другой фрагмент Окадзаки, лежащий ниже по течению, смещая 5 ’конец и образуя лоскут РНК. Затем активность 5 ’nuc Pol I расщепляет лоскут РНК, образуя разрезанный ДНК-субстрат, который впоследствии запечатывается ДНК-лигазой ( Фиг.1 A).Те же этапы обработки также выполняются Pol I во время эксцизионной репарации оснований ДНК, и в этом случае смещенная цепь состоит из ДНК ( Imai et al., 2007 ).
Рисунок 1.
Активности Pol I и трехмерные структуры гомологов Pol I. (A) Процессы, катализируемые Pol I во время репликации отстающей цепи ДНК или эксцизионной репарации оснований. Растущая цепь праймера удлиняется посредством повторяющихся циклов включения нуклеотидов, что приводит к смещению следующей цепи (РНК в случае созревания фрагмента Окадзаки или ДНК в случае эксцизионной репарации оснований).Полученный субстрат перестраивается в структуру с двойным лоскутом, которая расщепляется 5’-нуклеазной активностью Pol I (сайт обозначен полустрелкой). Этап анального лигирования выполняется ДНК-лигазой (не показана). (B) Кристаллическая структура полимеразы Pol I гомолога Taq с ДНК-праймером / матрицей, связанной в домене pol (PDB ID: 1TAU). Полимеразное ядро показано серым, а домен 5 ’nuc показан голубым. (C) Кристаллическая структура человеческого FEN1, связанного с ДНК-субстратом (PDB: 3Q8M).В обоих B и C нити ДНК окрашены, как в A.
Во время обработки фрагмента Окадзаки или эксцизионной репарации оснований Pol I должен достичь соответствующего баланса между активностями pol и 5 ‘nuc для генерации разорванный дуплексный продукт, который впоследствии может быть запечатан ДНК-лигазой ( Mortusewicz et al., 2006 ). Избыточная активность pol может привести к образованию длинных расположенных ниже 5′-створок, которые трудно расщепить ( Reha-Krantz, 2010 ), в то время как чрезмерная активность 5 ‘nuc может привести к образованию протяженных участков одноцепочечной ДНК, которые подвержены риску до поломки ( Zheng et al., 2005 ). Любой результат вреден для целостности генома и выживаемости клеток. Предыдущее биохимическое исследование предполагает, что отщепление 5’-лоскута осуществляется той же молекулой Pol I, которая расширила праймер ( Xu et al., 2000, ), что указывает на высокую степень функциональной координации. Однако структурная и физическая основа этой координации неизвестна, поскольку о кристаллических структурах Pol I, взаимодействующих с ДНК-субстратами через домены pol или 5 ’nuc , на сегодняшний день не сообщалось.Однако структура полимеразы Pol I гомолога Taq , связанной с ДНК ( Eom et al., 1996 ), показывает, что 3′-конец праймера расположен в области ладони домена pol , в то время как 5 ‘nuc домен расширен от ядра фермента ( Рисунок 1 B). Более того, структура человеческого FEN1, который гомологичен домену 5 ‘nuc Pol I, в комплексе с ДНК-субстратом обеспечивает модель того, как домен 5′ nuc Pol I взаимодействует с ДНК-субстратом ( Tsutakawa et al., 2011 ). В структуре показано одно неспаренное основание на 3′-конце праймера, вставленное в карман FEN1, и область протяженных контактов между белком и сахарно-фосфатными остовами обеих цепей нижерасположенной ДНК ( Рисунок 1 C) . Эти структуры гомологичных ферментов предполагают, что способы связывания Pol I pol и 5 ’nuc должны значительно отличаться, что вызывает вопросы о том, как фермент переключается с одного режима активности на другой.
Теоретическое моделирование перехода от активности pol к активности 5 ‘nuc в Pol I, начиная с расширенной конформации фермента, показанной на Рисунок 1 B, предполагает, что домен 5′ nuc меняется на ~ 180 ° и занимает положение над субдоменами пальцев и большого пальца в ядре фермента ( Xie and Sayers, 2011 ), облегчая взаимодействия с концевым основанием праймера и нижележащим лоскутом ДНК. Кроме того, вполне вероятно, что концевое основание праймера должно отсоединяться от домена pol для вставки в домен 5 ’nuc , как видно в структуре FEN1-ДНК ( Рисунок 1 C).Однако эти гипотетические перемещения ДНК-субстрата и 5 ’nuc домена не наблюдались экспериментально.
Здесь мы используем микроскопию одномолекулярного резонансного переноса энергии Ферстера (smFRET), чтобы исследовать физические основы функциональной координации в Pol I и исследовать крупномасштабные конформационные изменения комплекса фермент-ДНК. Метод smFRET ранее применялся к фрагменту Кленова (KF), который получен из Pol I путем удаления домена 5 ’nuc .В этих исследованиях отслеживался синтез ДНК с помощью KF ( Christian et al., 2009 ), обнаружены нуклеотид-индуцированные конформационные переходы внутри KF ( Santoso et al., 2010; Berezhna et al., 2012; Hohlbein et al. , 2013 ), наблюдали за переключением праймера ДНК между сайтами pol и exo KF ( Lamichhane et al., 2013 ) и создали структурную модель субстрата ДНК, связанного с KF ( Craggs et al., 2019 ). Однако smFRET еще не применялся к полноразмерному Pol I или любой другой ДНК-полимеразе, содержащей активность 5 ’nuc .
В этом исследовании мы разработали систему smFRET для идентификации отдельных субпопуляций ДНК, включающих домены pol и 5 ‘nuc Pol I, показывая, как фракционные популяции и время жизни каждого вида варьируются в зависимости от природы. субстрата ДНК. Мы также реализовали комплементарную систему smFRET для исследования местоположения гибко привязанного домена 5 ’nuc , обнаружив, что этот домен претерпевает большой сдвиг положения, чтобы взаимодействовать с расположенной ниже цепью ДНК.Важно отметить, что, используя обе системы smFRET, мы демонстрируем, что ДНК-субстраты могут переключаться между доменами pol и 5 ‘nuc во время одного контакта с Pol I. На основе кинетического анализа соответствующих переходов мы предлагаем физическую модель для внутримолекулярного переноса. ДНК между доменами pol и 5 ‘nuc . В целом, информация из экспериментов smFRET, представленных здесь, обеспечивает новое понимание физических механизмов и конформационных изменений ферментов, которые лежат в основе функциональной координации в Pol I и, вероятно, имеют отношение к другим многофункциональным ДНК-полимеразам с пространственно разделенными активными сайтами.
Результаты
Схема эксперимента
Мы разработали серию модельных ДНК-субстратов, содержащих элементы, которые, как ожидается, будут взаимодействовать с доменом 5 ‘nuc Pol I. Субстраты показаны в схематической форме на Рисунок 2 и полная Последовательности составляющих олигонуклеотидов перечислены в Приложении 1 . Один субстрат содержит одноцепочечный 5 ’лоскут на нисходящей цепи, называемый ДНК нисходящего лоскута ( , фиг. 2, A).Другой субстрат содержит расположенный ниже лоскут и одно неспаренное 3’-концевое основание на цепи праймера (называемое ДНК двойного лоскута, Рисунок 2 B). Третий субстрат может потенциально существовать в виде смеси нижележащих лоскутов и форм двойных лоскутов (называемых ДНК смешанных лоскутов, Рисунок 2 C). Мы также исследовали ДНК-субстраты, содержащие разрыв или разрыв различного размера ( Рисунок 2, D) или полностью лишенные нисходящей цепи ( Рисунок 2, E).Во всех случаях шаблон содержит спейсер dT 10 и группу биотина на 3 ’конце для прикрепления к поверхности. Индивидуальные встречи между Pol I, присутствующим в растворе, и поверхностно-иммобилизованными ДНК-субстратами были визуализированы с помощью микроскопии smFRET. Были использованы две разные схемы маркировки FRET, как описано в следующих разделах.
Рисунок 2.
ДНК-субстратов, использованных в этом исследовании. (A) Субстрат, содержащий 5 ’лоскут на нисходящей цепи (обозначенный ДНК нисходящего лоскута).(B) Субстрат, содержащий тот же 5 ’лоскут, что и в A, плюс одно неспаренное основание на 3’ конце праймера (обозначенная ДНК с двойным лоскутом). Из-за последовательностей оснований цепей ( Приложение 1 ) структуры, показанные в A и B, «заблокированы». (C) Субстрат, который может существовать как смесь структур, показанных в A и B (обозначенная ДНК смешанного лоскута). (D) Подложки, содержащие зазубрины ( n = 0) или зазоры различного размера ( n = 1-4). (E). Грунтовка / шаблон-основа.
Движение ДНК между доменами
pol и 5 ’nuc Pol I
Первая система FRET была разработана для исследования положения субстратов ДНК относительно ядра фермента. Основание, расположенное в цепи праймера, было помечено донором FRET Alexa Fluor 488 (A488), а Pol I был помечен в положении 550 в области большого пальца дополнительным акцептором FRET Alexa Fluor 594 (A594) ( Рисунок 3 A и Приложение 1-Таблица 1 ).Для достижения сайт-специфического мечения Pol I два нативных цистеина были удалены посредством мутаций C262S и C907S, и один цистеин был введен в желаемый сайт мечения посредством мутации K550C. Конструкция Pol I также содержала мутации D424A и D116A для устранения 3-5 ’экзонуклеазной и 5’ нуклеазной активностей, соответственно ( Derbyshire et al., 1991; Xu et al., 2001, ). Pol I экспрессировали и очищали, как описано в разделе «Методы», и каждую стадию процесса очистки контролировали с помощью PAGE ( , приложение 2, ).
Рисунок 3.
Зондирование расположения ДНК-субстратов в Pol I. (A) Схематическое изображение донорного (зеленый, прикрепленный к цепи праймера) и акцептора (оранжевый, прикрепленный к области большого пальца Pol I) сайтов мечения. Pol I изображен в мультяшной форме, с сердцевиной, окрашенной в серый цвет, а домен 5 ’nuc — в синий. (B) Типичная траектория smFRET (синий) и донорные (зеленые) и акцепторные (пурпурные) траектории излучения для Pol I, взаимодействующего со смешанной подложкой закрылка. Жирная линия — это идеализированный путь состояний, определенный на основе скрытого марковского моделирования.(C) Составные гистограммы эффективности FRET для состояний P и N, составленные в ходе глобального скрытого марковского анализа, для различных комбинаций ДНК-субстрата и белка. Белки сверху вниз — это WT Pol I, Pol I L361A и KF L361A. Указаны соответствующие населенности состояний P и N. (D) Графики переходной плотности для Pol I, взаимодействующего с ДНК-субстратами, содержащими лоскут. Слева направо: ДНК двойного лоскута, ДНК смешанного лоскута и ДНК нижнего лоскута. (E) Константы скорости внутримолекулярного переноса ДНК-субстратов от домена pol к домену 5 ‘nuc (P → N) по сравнению с общими скоростями диссоциации от домена pol (P → U, где U означает несвязанный) .(F) Константы скорости внутримолекулярного переноса ДНК-субстратов от домена 5 ’nuc к домену pol (N → P). Смешанная ДНК лоскута демонстрирует две скорости переноса ( Рисунок 3-Рисунок Дополнение 1 ), оба из которых показаны.
Рисунок 3-Дополнение к рисунку 1. Гистограммы времени выдержки для Pol I, взаимодействующего с подложками, содержащими лоскут
Рисунок 3-Дополнение к рисунку 2. Гистограмма интенсивности излучения, возникающего в результате прямого возбуждения A594 в Pol I, связанном с нижним потоком лоскут ДНК.
Рисунок 3 — Дополнение к рисунку 1.
Гистограммы времени пребывания для переходов с переключением домена WT Pol I, взаимодействующего с содержащими лоскут ДНК-субстратами. Сплошные линии лучше всего подходят для одной экспоненциальной функции с указанными константами скорости. Переход N → P для подложки со смешанным клапаном требует биэкспоненциальной функции для наилучшего соответствия (пунктирная линия). Показаны индивидуальные константы скорости.
Рисунок 3 — Дополнение к рисунку 2.
Гистограмма интенсивности излучения в результате прямого возбуждения A594 в Pol I, связанном с нижележащей ДНК лоскута.Единственный пик с центром около 350 а.е. указывает на то, что с ДНК связывается только одна молекула фермента. Пик при ∼0 а.е. соответствует периодам, в течение которых Pol I не связывается с ДНК.
Репрезентативный набор траекторий эффективности донора, акцептора и FRET, изображающий серию встреч между Pol I и иммобилизованной ДНК (смешанный лоскут в этом примере), показан на Рисунок 3 B. Во время каждого контакта интенсивность донора резко возрастает. падает, и в тот же момент появляется сигнал акцептора, отражающий связывание Pol I с ДНК, в то время как в более поздний момент времени сигнал акцептора исчезает, а сигнал донора соответственно увеличивается, отражая диссоциацию Pol I от ДНК.Антикорреляция сигналов донора и акцептора подтверждает, что изменения интенсивности вызваны FRET. Во время периодов связывания эффективность FRET чередуется между двумя различными уровнями с эффективностью ~ 0,8 или ~ 0,6. Множественные траектории FRET для каждого ДНК-субстрата, взаимодействующего с Pol I, были проанализированы в глобальном масштабе с использованием скрытой марковской модели, подтвердив, что двух различных состояний достаточно для учета всех наборов данных. Полученные составные гистограммы эффективности FRET для каждого состояния показаны на рис. 3 C.Обратите внимание, что каждая гистограмма накапливается во время глобального HMM-анализа, а не путем гауссовой подгонки конечных огибающих, обеспечивая четкое разделение двух состояний и точную количественную оценку совокупностей состояний.
Состояние с эффективностью 0,8 FRET ранее наблюдалось для праймеров / матриц ДНК, взаимодействующих с KF (те же донорные и акцепторные участки мечения, что и здесь), и было приписано ДНК, взаимодействующей с доменом pol ( Lamichhane et al., 2013 ). Поскольку KF идентичен основному ядру Pol I, 0.Наблюдаемое здесь состояние FRET также приписывается ДНК, взаимодействующей с доменом pol внутри Pol I (состояние P). Чтобы проверить, возникает ли состояние 0.6 FRET в результате связывания ДНК с доменом exo Pol I, мы ввели мутацию L361A, которая, как известно, нарушает связывание ДНК в домене exo KF ( Lamichhane et al., 2013; Лам и др., 1998 ). Мутация L361A мало влияет на популяцию 0,6 FRET (сравните верхний и средний ряды в , рис. 3, , C), указывая на то, что это состояние не возникает в результате связывания ДНК с доменом exo .Мы также исследовали KF, в котором полностью отсутствует домен 5 ’nuc . Конструкция KF также была помечена в положении 550 с помощью A594 и содержала мутацию L361A. Примечательно, что популяция 0,6 FRET не наблюдается с KF ( Рисунок 3 C, нижний ряд). В совокупности эти наблюдения показывают, что состояние 0,6 FRET возникает из-за взаимодействия ДНК с доменом 5 ’nuc Pol I (состояние N).
Более низкая эффективность FRET состояния N может быть связана с движением восходящего дуплекса (где находится донор), когда конец праймера отделяется от домена pol и перемещается к домену 5 ‘nuc , наклоняя белковая спираль, к которой прикреплен акцептор, или изменения в локальном окружении донора и / или акцептора, которые изменяют радиус Ферстера.Фотофизические контрольные эксперименты показывают, что радиус Ферстера в состоянии N аналогичен радиусу Фёрстера в состоянии P ( Приложение 3 ), что указывает на то, что более низкая эффективность FRET в состоянии N обусловлена физическим движением субстрата ДНК и / или субдомена большого пальца. . Однако, поскольку субдомен большого пальца является жестким структурным элементом внутри Pol I и KF, вполне вероятно, что изменение FRET действительно происходит из-за движения субстрата ДНК. Изменение эффективности FRET с 0,8 до 0,6 соответствует удлинению донорно-акцепторного расстояния на ~ 7 Å ( Приложение 3 ).
Состояние N наиболее заселено для субстрата с двойным лоскутом ( Рисунок 3 C, вверху слева), что согласуется с известным предпочтением активности Pol I в отношении активности Pol I с 5 ‘ядерным ядром для структур с двойным лоскутом ( Xu et al., 2001, 2000, ). Напротив, состояние N наименее заселено нижележащей подложкой откидной створки ( , фиг. 3, , C, вверху справа). Гистограмма FRET для субстрата смешанного лоскута показывает промежуточную популяцию состояния N ( фиг. 3 C, вверху в центре), что согласуется с тем, что этот субстрат существует как смесь форм двойного лоскута и нижнего лоскута.
Двумерные графики переходной плотности (TDP) ( McKinney et al., 2006 ) были построены из множества траекторий FRET, чтобы выявить взаимосвязь различных состояний FRET (рис. 3D). Два пика на оси ординат отражают связывание Pol I с иммобилизованной ДНК с использованием доменов pol или 5 ’nuc . Анализ времени выдержки показывает, что скорости связывания через любой домен аналогичны и находятся в диапазоне, ожидаемом для процесса связывания, контролируемого диффузией ( Приложение 4-Таблица 1 ), что указывает на то, что оба домена одинаково доступны.Пики на оси абсцисс отражают соответствующие переходы диссоциации. Анализ времени выдержки показывает, что субстрат с двойным лоскутом демонстрирует самую быструю диссоциацию от домена pol и самую медленную диссоциацию от домена 5 ’nuc ( Приложение 4-Таблица 1 ). Константы равновесной диссоциации, рассчитанные из кинетических констант скорости, также перечислены в Приложение 4-Таблица 1 .
Эти результаты предполагают, что Pol I может взаимодействовать с ДНК через один домен ( pol или 5 ’nuc ), диссоциировать в основной объем раствора и впоследствии повторно связываться с использованием другого домена.Пример такой последовательности событий (отделение от состояния N и повторное связывание в состоянии P) очевиден на репрезентативной траектории smFRET, показанной на рис. 3 B (средняя часть, от ~ 6 с до ~ 8 с). Диссоциация и повторное связывание обеспечивают один путь переноса ДНК-субстратов между доменами pol и 5 ’nuc (межмолекулярный перенос). Кроме того, мы наблюдаем частые переходы между состояниями P и N, которые не показывают измеримую паузу в состоянии с нулевым FRET (пример также показан на Рисунок 3 B, между ~ 8 с и ~ 10 с).Такие переходы приводят к появлению заметных кросс-пиков между состояниями FRET от 0,6 до 0,8 в TDP ( Рисунок 3 D). Константы скорости этих прямых переходов из состояния P в N (внутримолекулярный перенос) были определены анализом времени пребывания для каждого субстрата ДНК ( Рисунок 3-Рисунок Дополнение 1 и Приложение 4-Таблица 2 ). Интересно, что скорости переноса для субстратов с двойным лоскутом и нижнего лоскута аналогичны соответствующим скоростям, с которыми Pol I, связанный через домен pol , диссоциирует в объемный раствор ( Рисунок 3 E, верхняя панель).
Есть две модели, которые учитывают прямые переходы между состояниями P и N и соответствие между скоростями переноса и скоростями диссоциации. Во-первых, Pol I, связанный с ДНК через домен pol , может спонтанно диссоциировать и повторно захватываться той же молекулой ДНК через домен 5 ’nuc перед тем, как уйти в основной раствор. Альтернативно, две молекулы Pol I могут связываться с одним субстратом ДНК, одна из которых взаимодействует с ДНК через домен pol , а другая — через домен 5 ’nuc .Диссоциация первой молекулы Pol I приведет к переходу от 0,8 до 0,6 эффективности FRET. Чтобы различить эти возможности, мы оценили стехиометрию Pol I на каждом из субстратов ДНК. Для этого мы возбуждали акцептор A594 напрямую и регистрировали результирующее излучение A594 с течением времени в тех же условиях, что и в экспериментах с smFRET. Гистограмма интенсивности излучения A594, составленная из> 100 отдельных молекул Pol I, взаимодействующих с иммобилизованной ДНК (нижний лоскут в этом примере), показывает пик при ~ 350 а.u. ( Рисунок 3-Рисунок Дополнение 2 ), что соответствует одной молекуле Pol I, связанной с ДНК (пик с нулевой интенсивностью связан с периодами, в которые Pol I не связывается с ДНК). Примечательно, что нет никаких указаний на пик или плечо на ~ 700 а.е., соответствующих двум связанным молекулам Pol I. Аналогичные результаты были получены для других субстратов ДНК (не показаны). Мы пришли к выводу, что одна молекула Pol I связана с ДНК в условиях наших экспериментов, что исключает второй сценарий, описанный выше.Основываясь на подсчете соответствующих переходов для двойной лоскутной ДНК, 64% событий выхода из домена pol приводят к переносу в домен 5 ‘nuc , в то время как оставшиеся 36% приводят к утечке в основной раствор ( Приложение 4-Таблица 3 ).
Интересно, что скорость переноса с pol на 5 ’nuc для подложки со смешанным клапаном совпадает со скоростью переноса для подложки с двумя клапанами ( Рисунок 3 E, верхняя панель).Как отмечалось выше, субстрат смешанного лоскута потенциально может существовать как смесь форм двойного лоскута и нижнего лоскута. Кинетические результаты в Рисунок 3 E предполагают, что скорость переноса от домена pol к домену 5 ‘nuc регулируется формой двойного лоскута, тогда как общая диссоциация от домена pol отражает оба двойная заслонка и форма заслонки после клапана
Анализ времени выдержки показывает значительные различия в скоростях внутримолекулярного переноса из состояния N в состояние P среди различных субстратов ДНК ( Рисунок 3 E, нижняя панель и Приложение 4-Таблица 2 ).Нижний по потоку субстрат клапана демонстрирует самый быстрый перенос. Напротив, перенос субстрата с двойным лоскутом происходит намного медленнее, что показывает важность неспаренной основы праймера для стабильного взаимодействия с доменом 5 ’nuc . Структура FEN1 (гомологичного домену 5 ‘nuc Pol I) с ДНК показывает, что неспаренное основание праймера изолировано в связывающем кармане, создавая контакты с сетью окружающих белковых остатков ( Tsutakawa et al., 2011 ).Подобное расположение в Pol I могло бы объяснить длительное время пребывания ДНК в состоянии N и медленное возвращение в состояние P. Интересно, что гистограмма времени пребывания для смешанного субстрата лоскута не подходит для единственной экспоненциальной функции и вместо этого требует биэкспоненциальная функция для наилучшего соответствия ( Рисунок 3 — Дополнение к рисунку 1 ). Более того, константы скорости для быстрой и медленной кинетических фаз соответствуют скоростям переноса, наблюдаемым для нижележащих лоскутов или подложек с двойными лоскутами, соответственно ( Рисунок 3 E, нижняя панель).Это наблюдение согласуется с ожиданием того, что смешанный субстрат лоскута существует в виде смеси форм нижнего лоскута и двойного лоскута, и дополнительно показывает, что две субпопуляции могут быть разделены кинетически.
Роль нижестоящей цепи и 5′-створки в связывании с сайтом
5 ‘nuc
Чтобы выяснить, требуется ли присутствие нижестоящей цепи для взаимодействия с доменом 5′ nuc , мы исследовали ДНК-субстрат, содержащий только нити праймера и матрицы ( Рисунок 2 E и Приложение 1-Таблица 1 ).Эта подложка демонстрирует одно состояние FRET с эффективностью ~ 0,8, что соответствует состоянию P, при взаимодействии с Pol I ( Рисунок 4 A и B, нижние панели). Точно так же перекрестные пики не наблюдаются в TDP ( Рисунок 4 C). Состояние N отсутствует в этом случае, показывая, что нижележащая ДНК должна быть в дуплексной форме, чтобы взаимодействовать с доменом 5 ’nuc и способствовать перемещению вышележащей ДНК из домена pol .
Рисунок 4.
Взаимодействие Pol I с праймером / матрицей ДНК или ДНК-субстратами, содержащими разрыв или разрыв.(A) Репрезентативные траектории smFRET для ДНК-субстратов, взаимодействующих с Pol I, как указано. Схематические изображения субстратов ДНК показаны в Рисунок 2 . Жирные линии — это идеализированные пути состояний, определенные на основе скрытого марковского моделирования. (B) Составные гистограммы эффективности FRET для состояний P и N, для различных ДНК-субстратов, взаимодействующих с Pol I, как указано. Указаны соответствующие населенности состояний P и N. (C) Графики переходной плотности для Pol I, взаимодействующего с различными субстратами ДНК, как указано.(D) Константы скорости внутримолекулярного переноса различных ДНК-субстратов между доменом pol и доменом 5 ‘nuc (P → N, серый) или между доменом 5′ nuc и доменом pol (N → P, синий ).
Рисунок 4 — Дополнение к рисунку 1. Гистограммы и TDP для Pol I L361A и KF, взаимодействующих с промежутком 1nt.
Рисунок 4 — Дополнение к рисунку 2. Гистограммы времени выдержки для Pol, взаимодействующего с подложками, содержащими зазубрины или зазоры
Рисунок 4 — Дополнение к рисунку 1.
Гистограммы эффективности композитного FRET (слева) и графики переходной плотности (справа) для Pol I L361A (верхние панели) и KF (нижние панели), взаимодействующих с подложкой с зазором 1nt.
Рисунок 4 — Дополнение к рисунку 2.
Гистограммы времени выдержки для переходов с переключением домена WT Pol I, взаимодействующего с ДНК-субстратами, содержащими ники или пробелы. Сплошные линии лучше всего подходят для одноэкспоненциальной функции с указанными константами скорости.
Чтобы проверить, требуется ли наличие 5′-створки на нисходящей цепи для взаимодействия с доменом 5’nuc , мы исследовали ДНК-субстраты, содержащие разрывные или одноцепочечные разрывы различного размера ( Рисунок 2 D и Приложение 1-Таблица 1 ).Эти подложки обнаруживают обратимые переходы между состояниями ~ 0,6 и ~ 0,8 FRET при взаимодействии с Pol I ( Рис. 4 A, верхние три панели), аналогично подложкам, содержащим 5 ’створки. Кроме того, отличительные признаки состояния 0,6 FRET указывают на то, что ДНК взаимодействует с доменом 5 ’nuc (состояние N, Рисунок 4-Приложение 1 к рисунку ). Популяции состояния N для субстратов с разрывом и одиночным нуклеотидным разрывом (26% и 23%, соответственно, Рисунок 4 B) аналогичны субстрату нижнего лоскута (23%, Рисунок 3 C) , что указывает на то, что присутствие расположенной ниже цепи достаточно для взаимодействия с доменом 5 ‘nuc , независимо от того, содержит ли эта цепь 5′ створку или нет.Более того, домен 5 ‘nuc может взаимодействовать с нижележащей цепью, даже если он отделен от цепи праймера промежутком 4nt ( Рисунок 4 A и B), что, вероятно, является следствием гибкого линкера из 16 аминокислот привязка домена 5 ‘nuc к телу фермента. Гибкость одноцепочечной области гэпа также может способствовать стыковке домена 5 ’nuc с нижележащей цепью ДНК. Наличие заметных кросс-пиков в TDP показывает, что субстрат ДНК с разрывом может обратимо переноситься между доменами pol и 5 ‘nuc во время одного контакта с Pol I ( Рисунок 4 C), в то время как анализ времени пребывания ( Рисунок 4-Рисунок Дополнение 2 ( ) показывает, что перенос из домена pol в домен 5 ‘nuc становится все медленнее по мере увеличения размера зазора ( Рисунок 4 D и Приложение 4- Таблица 4 ).Аналогичным образом, возврат ДНК из домена 5 ’nuc в домен pol также происходит медленнее для больших размеров разрыва ( фиг. 4, , D и , приложение 4, таблица 4, ). Константы скорости связывания или диссоциации праймера / матрицы, ДНК-субстратов с разрывом и разрывом перечислены в Приложение 4-Таблица 5 .
Движение домена
5 ’nuc во время стыковки с нижележащей ДНК
Вторая система FRET предназначена для исследования близости домена 5’ nuc к нижележащей части субстратов ДНК.В этом случае донор A488 был присоединен к остатку цистеина, введенному в положение 213 в домене 5 ‘nuc Pol I (через мутацию aT213C), а акцептор A594 был присоединен к основанию в нижней части цепи матрицы. ( Рисунок 5A и Приложение 1-Таблица 2 ). В остальном субстраты ДНК были аналогичны тем, которые использовались на схеме 1. Акцептор A594 был помещен в матрицу, а не в нижнюю цепь, чтобы избежать любого возможного стерического вмешательства в связывание Pol I.Конструкция Pol I также содержала мутации C262S, C907S, D424A и D116A, как описано выше. Репрезентативный набор траекторий эффективности донора, акцептора и FRET для смешанного ДНК-субстрата лоскута показан на Рисунок 5 B. присутствует на ДНК. При связывании Pol I одновременно появляются донорные и акцепторные сигналы, и их относительные величины отражают эффективность FRET во время встречи.При диссоциации Pol I оба сигнала исчезают в один и тот же момент ( Рисунок 5 B).
Рис. 5.
Исследование местоположения домена 5 ’nuc в комплексах Pol I-ДНК. (A) Схематическое изображение сайтов мечения донора (желтый, прикрепленный к 5 ’nuc домену ) и акцептора (голубой, прикрепленный к нисходящей цепочке матрицы). (B) Репрезентативный набор траекторий донора, акцептора и FRET для смешанного лоскутного ДНК-субстрата. (C) Гистограммы эффективности FRET, составленные из нескольких траекторий.(D) Графики переходной плотности, составленные из тех же наборов данных в (C). Поскольку эффективность FRET не определяется в периоды, когда Pol I не связан с ДНК, эффективность FRET установлена на -0,2. Квадрант, обведенный пунктирными линиями, соответствует периодам, в течение которых Pol I связывается с ДНК.
Множественные траектории FRET для каждого субстрата ДНК (содержащего 5’-створку), взаимодействующего с Pol I, были проанализированы в глобальном масштабе с использованием скрытой марковской модели, показав, что двух различных состояний было достаточно для учета всех наборов данных.Результирующие гистограммы эффективности FRET для каждого состояния центрированы при эффективности ~ 0,8 и ~ 0,6 ( Рисунок 5 C). Примечательно, что фракционные популяции пиков с высоким FRET и средним FRET аналогичны фракционным популяциям состояний N и P, соответственно, наблюдаемым с первой схемой мечения (сравните Рисунок 5 C и Рисунок 3 С). Это справедливо для всех трех подложек, содержащих 5 ’створки, которые по-разному распределяются между состояниями N и P.Соответственно, разновидности с высоким FRET и средним FRET, наблюдаемые с настоящей схемой мечения, также относятся к состояниям N и P соответственно. Высокая эффективность FRET состояния N указывает на то, что донорные и акцепторные сайты относительно близки в пространстве (расстояние донор-акцептор ~ 40Å), подтверждая, что состояние N возникает в результате взаимодействия домена 5 ’nuc с нижележащей ДНК. Более низкая эффективность FRET состояния P указывает на то, что домен 5 ’nuc находится несколько дальше от нижележащей ДНК, когда 3’ конец праймера занимает домен pol (расстояние донор-акцептор ~ 49 Å).Прямые переходы между состояниями среднего FRET и высокого FRET наблюдаются на отдельных траекториях FRET ( Рисунок 5 B) и в составных TDP ( Рисунок 5 D), что указывает на то, что Pol I может переключаться между состояниями P и N без диссоциации. Этот вывод согласуется с наблюдениями по первой схеме маркировки ( Рисунок 3 D).
В противоположность этому, субстрат праймер / матрица в основном заполняет одно состояние FRET с гораздо более низкой эффективностью ~ 0.3 ( , рис. 6, , ), что указывает на то, что домен 5 ’nuc удален от нижележащей матрицы (расстояние донор-акцептор ~ 60Å). Обозначим это состояние P ’(см. Обсуждение). Гистограмма FRET также показывает едва заметное плечо при эффективности ~ 0,6, что соответствует состоянию P ( Рисунок 6 C). Существует очень мало переходов между состояниями P ’и P, на что указывает отсутствие кросс-пиков в TDP ( Рисунок 6 D).В целом, эти наблюдения согласуются с первой схемой мечения, которая указывает, что нижележащая ДНК должна присутствовать в дуплексной форме, чтобы взаимодействовать с доменом 5 ’nuc ( Фиг.4 B).
Рисунок 6.
Расположение домена 5 ’nuc внутри Pol I, связанного с праймером / субстратом-матрицей. (A) Схематическое изображение сайтов мечения донора (желтый) и акцептора (голубой). (B) Репрезентативный набор траекторий донора, акцептора и FRET.(C) Гистограммы эффективности FRET, составленные из нескольких траекторий. (D) График плотности переходов, составленный из тех же наборов данных, что и в C. То же представление, что и Рисунок 5 D.
Обсуждение
Домен 5 ‘nuc Pol I выполняет ключевую функцию во время репликации ДНК и ремонт, отщепление 5 ‘створок, которые возникают в результате синтеза смещения цепи ( Рисунок 1 A). Физические и структурные механизмы, лежащие в основе координации между активностями pol и 5 ’nuc Pol I, недостаточно изучены из-за технических проблем при изучении этого фермента.Домен 5 ’nuc связан с ядром фермента неструктурированным пептидным линкером из 16 аминокислот, что может позволить этому домену занять ряд положений. Эта внутренняя гибкость, вероятно, препятствовала попыткам кристаллизовать Pol I и определить кристаллическую структуру с высоким разрешением. Более фундаментально, потенциальная способность домена 5 ’nuc к обмену между различными положениями в комплексе Pol I-ДНК может играть роль в организации перехода от одного режима ферментативной активности к другому.
Здесь мы разработали две дополнительные системы smFRET для визуализации спонтанного обмена Pol I между различными способами связывания ДНК и для исследования местоположения домена 5 ’nuc в каждом случае. Используя первую схему мечения, мы выделили два различных состояния FRET и показали, что они соответствуют ДНК, взаимодействующей с доменом pol (состояние P) или взаимодействующей с доменом 5 ’nuc (состояние N). Хотя мы ранее наблюдали режим связывания pol в аналогичных исследованиях smFRET KF ( Lamichhane et al., 2013 ), о настоящих спектроскопических наблюдениях моды связывания 5 ’nuc в полноразмерном Pol I ранее не сообщалось. Используя вторую схему мечения, мы подтвердили, что состояние N возникает в результате стыковки домена 5 ’nuc с нижележащей ДНК. Примечательно, что фракционные популяции состояний P и N, определенные для каждой схемы мечения, согласуются ( Рисунок 3, , C и Рисунок 5, C), что дает согласованное описание изучаемых комплексов Pol I-ДНК.Напротив, если нижележащая цепь отсутствует, домен 5 ’nuc занимает другое положение, расширенное от ДНК-субстрата ( Фиг.6, ), что подчеркивает подвижность этого независимого и гибко привязанного белкового домена.
Хотя структуры полноразмерного Pol I с ДНК-субстратами недоступны, наши спектроскопические данные о состояниях P и N согласуются с деталями, обнаруженными в структурах гомологичных ферментов, связанных с ДНК-субстратами.Кристаллическая структура полимеразы Taq с праймером / матрицей ДНК, взаимодействующим с доменом pol , показывает, что 3′-концевое основание праймера расположено в щели в области ладони ( Eom et al. (1996) , Рисунок 1 B). Напротив, структура FEN1 (гомологичного домену 5 ‘nuc Pol I) в комплексе с ДНК-субстратом выявляет неспаренное 3′-концевое основание, расположенное в кармане, окруженном кластером белковых остатков ( Tsutakawa et al. al.(2011) , Рисунок 1 C). В контексте Pol I эти две структуры предполагают, что концевое основание праймера отделяется от домена pol и вставляется в домен 5 ‘nuc , что согласуется с нашим наблюдением, что дуплекс ДНК подвергается смещению на ~ 7 Å между состояния P и N. Более того, наблюдение, что концевое основание праймера не является спаренным в структуре FEN1, согласуется с нашими спектроскопическими наблюдениями, согласно которым состояние N наиболее сильно заселено субстратом ДНК с двойным лоскутом ( Рис. Рисунок 5 C).Структура FEN1 также показывает область расширенных контактов между белком и сахарно-фосфатными остовами обеих цепей нижерасположенной ДНК ( Tsutakawa et al., 2011 ), что согласуется с нашими наблюдениями, что нижележащая ДНК должна находиться в дуплексная форма для взаимодействия с доменом 5 ‘nuc ( Рисунок 4, B) и что нижележащая цепь взаимодействует с доменом 5′ nuc Pol I, даже когда он отделен от конца праймера зазором 4nt ( Рисунок 4 B).
Важным открытием нашего исследования smFRET является то, что ДНК-субстраты могут обратимо переноситься между доменами pol и 5 ‘nuc во время одного столкновения с Pol I. Эти внутримолекулярные переходы легко наблюдаются на отдельных траекториях FRET ( Рисунок 3 B и Рисунок 5 B) и в составных графиках переходной плотности ( Рисунок 3 D и Рисунок 5 D), полученных с использованием любой схемы маркировки.Наши результаты объясняют предыдущие биохимические наблюдения, указывающие на то, что та же самая молекула Pol I, которая удлиняет конец праймера, может также расщеплять образовавшийся нижерасположенный лоскут ( Xu et al., 2000 ). Путь внутримолекулярного переноса также используется во время переключения с pol на exo в KF ( Lamichhane et al., 2013; Joyce, 1989, ). Что наиболее важно, наши результаты дают представление о физических механизмах, которые облегчают перенос ДНК из домена pol в домен 5 ’nuc в Pol I.Анализ времени выдержки показывает, что скорость переноса соответствует скорости диссоциации из домена pol в объемный раствор для субстратов с двойным клапаном и нижележащего клапана ( Рисунок 3 E). Эти результаты предлагают модель внутримолекулярного переноса, при которой Pol I, связанный через домен pol , спонтанно отделяется от ДНК и немедленно повторно связывает ту же молекулу ДНК через домен 5 ’nuc перед тем, как уйти в объемный раствор.
Фактически, домен 5 ’nuc , по-видимому, позиционируется соответствующим образом, чтобы действовать таким образом.На основе второй системы FRET расстояние донор-акцептор в состоянии P (~ 49 Å) находится в диапазоне, аналогичном состоянию N (~ 40 Å), что позволяет предположить, что домен 5 ‘nuc находится относительно близко к нижестоящая ДНК, когда 3′-конец праймера расположен в домене pol . Такое расположение увеличивает вероятность того, что домен 5 ’nuc будет захватывать тот же субстрат ДНК после диссоциации Pol I. Это согласуется с нашим наблюдением, что 64% всех переходов из домена pol приводят к прямому переносу в домен 5 ’nuc ( Приложение 4-Таблица 3 ).Напротив, если нижележащая цепь ДНК отсутствует, домен 5 ’nuc занимает более отдаленное положение с расстоянием между донором и акцептором ~ 60 Å ( Рисунок 6 B & C). Мы не наблюдаем никаких прямых переходов между доменами pol и 5 ’nuc в этих условиях ( Фиг.4, C и Фиг.6, D).
Взятые вместе, результаты двух FRET-систем предполагают, что комплексы Pol I с ДНК могут принимать три различные конфигурации, схематически представленные в виде Рисунок 7 .Комплекс P ’образуется исключительно с субстратом праймер / матрица: 3’ конец праймера связан с доменом pol , а домен 5 ’nuc отходит от ядра фермента. Первичный символ позволяет отличить этот вид от комплекса P, который образуется с ДНК-субстратами, содержащими нижележащую цепь: 3 ‘конец праймера все еще находится в домене pol , но домен 5′ nuc находится рядом с нить по потоку. Комплексы P и P ’неотличимы при использовании первой схемы мечения, но четко разрешаются при использовании второй схемы, что подчеркивает важность использования нескольких донорных и акцепторных сайтов для обнаружения всех присутствующих видов.В комплексе N домен 5 ’nuc находится в непосредственной близости от нисходящей цепи, и конец праймера смещен с домена pol на домен 5’ nuc . Наши результаты показывают, что комплексы P и N могут свободно преобразовываться друг в друга, причем распределение этих двух видов определяется природой субстрата ДНК. Комплекс P является доминирующим видом для субстратов нижележащего лоскута и 1nt гэпа, с временными переходами к комплексу N. Напротив, субстрат с двойным лоскутом смещен в сторону комплекса N, что согласуется с известным предпочтением субстрата для активности 5 ‘nuc Pol I ( Xu et al., 2001, 2000 ). Теоретическое моделирование также предполагает, что домен 5 ’nuc может принимать различные положения в комплексе Pol I-ДНК ( Xie and Sayers, 2011 ).
Рис. 7.
Рис. 7: Возможные конфигурации комплексов Pol I-ДНК. (А) Комплекс P ’. В отсутствие ближайшей нисходящей цепи 3 ’конец праймера находится в домене pol , а домен 5’ nuc простирается от ядра фермента. Донорные и акцепторные зонды для первой схемы маркировки имеют зеленый и пурпурный цвета соответственно, а донорные и акцепторные зонды для второй схемы маркировки — желтые и синие.Эффективности FRET для первой и второй схем маркировки обозначены E 1 и E 2 соответственно. (B) Комплекс P. 3 ’конец праймера находится в домене pol , а домен 5’ nuc расположен рядом с ближайшей нисходящей цепью. Другие детали, как в A. (C) Комплекс N. 5 ’nuc домен стыкован с нисходящей цепью, и 3’ конец праймера ДНК находится в том же домене. Другие детали, как в A.
Комплексы в Фиг.7 , вероятно, соответствуют снимкам во время синтеза смещения цепи и переходу от активности pol к активности 5 ’nuc ( Фиг.1 A).Комплекс P ’соответствует ранней стадии, когда возникающая цепь праймера удалена от цепи, расположенной ниже по течению. Комплекс P соответствует более поздней стадии, на которой растущий праймер вытеснил нижележащую цепь, но 3 ’конец праймера все еще находится в домене pol . Комплекс N, вероятно, представляет собой следующий этап пути, на котором 3 ‘конец праймера переместился из домена pol , а домен 5′ nuc готов к расщеплению ножничного фосфодиэфира внутри нижерасположенной цепи, хотя на самом деле стадия расщепления здесь блокируется мутацией D116A.Будущие исследования smFRET с активным Pol I д. Обеспечить дальнейшее понимание временного порядка событий и связанных ферментов и конформационных изменений ДНК вдоль пути.
ДНК-полимеразы многих организмов также обладают различными ферментативными активностями, которые необходимо тщательно координировать, чтобы гарантировать точную и эффективную репликацию и репарацию ДНК. В ДНК Pol III основная репликативная полимераза в E. coli , активные сайты pol и exo расположены в отдельных белковых субъединицах в составе мультибелкового холоферментного комплекса ( McHenry, 2011; Oakley, 2019 ).Аналогичная ситуация преобладает в ДНК-полимеразах эукариот ( Burgers, Kunkel, 2017; Raia et al., 2019 ). Более того, у эукариот расщепление 5 ’лоскута осуществляется отдельным ферментом, таким как FEN1 ( Dehé and Gaillard, 2017; Stodola and Burgers, 2017 ). Pol I представляет собой относительно простую модель многофункциональных ДНК-полимераз, поскольку она содержит три различных активности в одном полипептиде и не требует дополнительных белков для правильного функционирования.Здесь мы показали, что ДНК-субстраты могут обратимо переноситься между доменами pol и 5 ‘nuc во время одного контакта с Pol I. Более того, наши результаты показывают, как гибко связанный домен 5′ nuc регулирует свое положение для облегчения переноса. ДНК от pol до 5 ‘nuc доменов. Основываясь на этих наблюдениях, мы предложили физический механизм передачи и функциональной координации. Внутримолекулярный перенос ДНК-субстрата в сочетании с конформационными изменениями белка управляет переходом от одного режима активности к другому без необходимости демонтировать и повторно собирать комплекс фермент-ДНК.Эта парадигма функциональной координации, вероятно, актуальна для более сложных многофункциональных комплексов голоферментов ДНК-полимеразы, в которых различные активные центры также широко разделены в пространстве, хотя и в пределах отдельных белковых субъединиц.
Методы и материалы
Олигонуклеотиды
Все олигонуклеотиды ДНК были приобретены у IDT в очищенной форме и использованы в том виде, в каком они были доставлены. Олигонуклеотиды, содержащие модифицированный аминогруппой dT, метили либо эфиром Alexa Fluor 488, либо эфиром NHS Alexa Fluor 594 (ThermoFisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя.Нити матрицы содержали группу биотина на 3’-конце для иммобилизации на покрытых нейтравидином предметных стеклах микроскопа. Все олигонуклеотидные последовательности и модификации перечислены в Приложение 1 — Таблица 1 и Приложение 1 — Таблица 2 .
Экспрессия производных Pol I
Вектор экспрессии Pol I был получен из плазмиды pXS67 (Yale Coli Genetic Stock Center, штамм CJ803) путем сайт-направленного мутагенеза с использованием набора QuikChange (Agilent) в соответствии с протоколом производителя.Эта конструкция, называемая в тексте диким типом (WT), также несла мутации C262S и C907S для удаления двух нативных цистеинов в Pol I, мутацию D424A для подавления 3′-5′-экзонуклеазной активности, мутацию D116A для подавления 5′-нуклеазная активность и 6-кратная гистидиновая метка, прикрепленная к С-концу белка линкером Gly-Pro-Gly. Конструкцию Pol I, содержащую дополнительную мутацию L361A, получали из конструкции WT посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза Q5 (NEB) в соответствии с протоколом производителя.KF, несущий мутации K550C, D424A и C907S (и L361A, как указано), был получен из ранее описанной плазмиды ( , Berezhna et al., 2012; Lamichhane et al., 2013, ). Экспрессию и очистку KF проводили, как описано ранее ( , Berezhna et al., 2012; Joyce and Derbyshire, 1995, ). Pol I был выражен таким же образом и очищен, как подробно описано ниже.
Очистка производных Pol I
Клетки, экспрессирующие Pol I, лизировали обработкой ультразвуком в буфере A HisTrap (50 мМ Tris-HCl, pH 7.5,10 мМ β -меркаптоэтанол, 10 мМ имидазол) с добавлением 20 мкМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 7500 × g в течение 15 минут при 4 ° C, и осветленный клеточный экстракт загружали в 5-мл колонку HisTrap HP (GE Life Sciences), уравновешенную буфером HisTrap A. Колонку промывали 5 мл. объем колонки HisTrap Buffer A, и белок элюировали HisTrap Buffer B (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 10 мМ β -меркаптоэтанол, 250 мМ имидазол).Затем фракции, содержащие Pol I, загружали в 5-мМ колонку HiTrap Heparin HP (GE Life Sciences), уравновешенную гепариновым буфером A (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5,1 мМ DTT). Белок элюировали градиентом 0-50% гепаринового буфера B (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 1 мМ DTT, 2M NaCl). Все стадии очистки контролировали с помощью анализа PAGE ( Приложение 2 ). Фракции, содержащие Pol I, объединяли и заменяли на 50 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 7, с использованием колонки Econo-Pac 10DG (Bio-Rad) перед маркировкой.
Мечение флуорофором
Конструкции Pol I или KF
были помечены малеимидом Alexa Fluor A594 или Alexa Fluor A488 C5 (ThermoFisher Scientific) и очищены, как описано ранее ( Berezhna et al., 2012 ). Концентрации белка и эффективность мечения рассчитывались на основе оптического поглощения с использованием коэффициента экстинкции ε 280 = 86,180 M −1 см −1 , ε 590 = 90,000 M −1 см −1 и ε 495 = 71000 M −1 см −1 для Pol I, A594 и A488 соответственно.Эффективность маркировки обычно составляла от 65 до 100%. Очищенный меченый белок концентрировали с использованием центрифужного фильтра MWCO 50 кДа (EMD Millipore) и хранили при -80 ° C в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT и 50% (об. / Об.) Глицерина. .
Сбор данных smFRET
Сбор данных smFRET был выполнен с использованием специально созданного микроскопа TIRF на основе призмы, как описано ранее ( Бережна и др., 2012 ). Вкратце, камера для образцов была собрана с кварцевыми предметными стеклами, пассивированными полиэтиленгликолем и покрытыми нейтравидином ( Lamichhane et al., 2010 ). Биотинилированные ДНК-субстраты (20 пМ) пропускали в камеру для образцов и давали возможность уравновеситься в течение 5 минут. Камеру для образца промывали для удаления несвязанного субстрата, и в камеру вводили 5 нМ Pol I с добавлением 1 мМ пропилгаллата. Все растворы готовили в буфере для визуализации (50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ MgCl 2 , 0,5 мгмл -1 , 1 мМ DTT, 50 мМ NaCl и 2 мМ Trolox). Данные были собраны со временем интеграции 100 мс с использованием специальной программы сбора данных для отдельных молекул, которая управляла камерой CCD.Одномолекулярный донор и соответствующие временные траектории акцептора были извлечены из фильмов с использованием пользовательских сценариев, написанных на IDL. Все пакеты программного обеспечения для сбора данных были загружены с https://physics.illinois.edu/cplc/software.
Анализ данных smFRET
Весь анализ данных проводился с использованием специального программного обеспечения, написанного внутри компании с использованием Python и вспомогательных пакетов. График зависимости интенсивности отдельного донора и соответствующего акцептора от времени корректировали на фоновый сигнал путем вычитания медианного сигнала в каждом канале после фотообесцвечивания.Следы интенсивности акцептора также были скорректированы с учетом утечки из донорского канала, как было определено ранее ( Бережна и др., 2012 ). Траектории эффективности FRET рассчитывались как
где E — эффективность FRET в каждый момент времени, а I D и I A — соответствующие скорректированные интенсивности донора и акцептора, соответственно. Для дальнейшего анализа были выбраны следы, демонстрирующие антикоррелированные флуктуации интенсивностей донора и акцептора, постоянную общую интенсивность (сумма донора и акцептора) и одноступенчатые события фотообесцвечивания.
Скрытая марковская модель (HMM) была обучена глобально на всех выбранных трассах для конкретной комбинации белок / субстрат одновременно с использованием метода максимизации ожидания ( Rabiner, 1989 ). Для каждой модели минимальное количество состояний, которые адекватно соответствуют отдельным трассам, определялось вручную. После обучения модели алгоритм Витерби ( Rabiner, 1989 ) использовался для определения наиболее вероятного пути скрытого состояния для каждой траектории.Затем этот помеченный путь состояния использовался для агрегирования всех точек данных, принадлежащих определенному состоянию, с целью составления составных гистограмм эффективности FRET с использованием алгоритма оценки плотности ядра (KDE) (scikitlearn) с гауссовым ядром и полосой пропускания 0,04. Относительные заселенности различных состояний FRET были получены непосредственно во время составления соответствующих гистограмм. Графики переходной плотности ( McKinney et al., 2006 ) были построены с использованием KDE (ядро Гаусса, 0.04 bandwidth), где 2D точки в наборе обучающих данных были определены как медианная эффективность FRET в начальном и конечном состояниях. Гистограммы времени пребывания были построены с одинаковой шириной бинов по всему диапазону данных. Оптимальная ширина бина для каждой гистограммы оценивалась с использованием правила Фридмана-Диакониса.
где w, — ширина интервала, x — это массив времен выдержки, N — количество точек данных в x , а IQR — межквартильный диапазон данных.Константы кинетической скорости и связанные с ними неопределенности были рассчитаны с помощью гистограмм времени пребывания Аттинга с одно- или двухэкспоненциальными функциями (SciPy).
Благодарности
Мы благодарим Эдвина ван дер Сханса за техническую помощь с экспрессией и очисткой KF и Ашока Дениза за использование стационарного флуориметра.
Приложение 1
В следующих таблицах представлены различные олигонуклеотиды ДНК, используемые для создания каждого субстрата в текущем исследовании. В каждой строке перечислены (сверху вниз) праймер, матрица и нити, расположенные ниже по потоку для каждого субстрата.B указывает на концевую группу биотина, Y представляет собой аминомодифицированный тимин, используемый для мечения флуорофора, в то время как нуклеотиды в нижнем регистре маркируют несовпадающие (откидные) области в первичных и последующих цепях. Все подложки были приготовлены путем теплового отжига смеси олигонуклеотидов при 95 ° C в течение 5 минут с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры на лабораторном столе. Все смеси содержали молярное соотношение праймера, матрицы и последующих цепей 3: 1: 3, чтобы гарантировать, что все иммобилизованные субстраты содержат все цепи.
Приложение 1 Таблица 1.
Последовательности ДНК-олигонуклеотидов, используемых для конструирования субстратов для схемы FRET 1.
Приложение 1 Таблица 2.
Последовательности ДНК-олигонуклеотидов, используемых для конструирования субстратов для схемы FRET 2.
Приложение 2
Приложение 2 Рис. 1.
ПААГ-анализ стадий экспрессии и очистки Pol I. (M = маркер размера; FT = проточный)
Приложение 3
Контрольные эксперименты были выполнены, чтобы определить, есть ли какие-либо изменения спектроскопических параметров между состояниями P и N, которые могут изменить радиус Ферстера и тем самым вызвать изменения в эффективности FRET.Спектры стационарного излучения и значения поляризационной анизотропии были получены для ДНК-субстратов, меченных A488 ( Приложение 1 — Таблица 1 ), либо отдельно, либо в присутствии насыщающей концентрации немеченого Pol I. Аналогичным образом спектры излучения и значения анизотропии были получены для A594-меченого Pol I (помеченного в положении 550) либо в свободном в растворе, либо в присутствии избытка немеченой ДНК. Результаты сведены в Приложение 3-Таблица 1 .
Праймер / матрица демонстрирует небольшое увеличение общей интенсивности эмиссии A488 в присутствии немеченого Pol I. Напротив, по существу нет изменения интенсивности A488 при связывании Pol I с двойным лоскутным ДНК-субстратом. Анизотропия A488 значительно увеличивается в присутствии Pol I, как и ожидалось для связывания большого белка с ДНК, но конечные значения анизотропии аналогичны для каждого связанного субстрата. Следовательно, локальная вращательная подвижность A488 должна быть одинаковой для каждой связанной ДНК.
Интенсивность излучения A594, присоединенного к Pol I, мало изменяется при связывании любого из субстратов ДНК, указывая на то, что локальное окружение A594 не изменилось. Точно так же анизотропия A594 очень похожа во всех связанных комплексах, что указывает на то, что локальная вращательная подвижность зонда также не изменилась. Радиус Ферстера ( R 0 ) зависит от квантового выхода донора ( φ D ), спектрального перекрытия донора и акцептора ( Дж ), фактора ориентации ( κ 2 ) и другие параметры, как описано следующим уравнением
где n — показатель преломления окружающей среды, а R 0 — в единицах ангстрем ( Lakowicz, 2006 ).Поскольку донорная и акцепторная анизотропии очень похожи в каждом комплексе ДНК-белок, вероятно, что фактор ориентации имеет одинаковое значение в каждом случае. Спектральное перекрытие также должно быть одинаковым для каждого комплекса, поскольку мы не наблюдаем каких-либо спектральных сдвигов в испускании донора или поглощении акцептора (не показано). Единственная величина, которая до некоторой степени варьируется среди комплексов, — это квантовый выход донора. Предполагая, что внутреннее значение R 0 составляет 55,6 Å для пары A488 / A594 ( Gansen et al., 2018 ), и используя нормированные интенсивности доноров в Приложение 3 — Таблица 1 , мы прогнозируем значения R 0 57,0 Å для связанного праймера / матрицы и 55,0 Å для субстрата с двойным лоскутом. Поскольку подобранный праймер / матрица заполняет исключительно состояние P ( Рисунок 3 C), значение R 0 для этого состояния также должно быть 57,0 Å. Подложка с двойным клапаном разделяет состояния P (26%) и N (74%), подразумевая, что внутреннее значение R 0 для состояния N несколько меньше 55.0 Å. В целом мы заключаем, что радиусы Ферстера для состояний P и N очень похожи.
Кажущееся расстояние донор / акцептор R , соответствующее эффективности FRET E , было рассчитано следующим образом
Приложение 3 Таблица 1.
Контроли стабильной флуоресценции
Приложение 4
Приложение 4 Таблица 1.
Кинетические и термодинамические свойства связывания и диссоциации Pol I, взаимодействующего с содержащими лоскут ДНК-субстратами
Приложение 4 Таблица 2.